一、真菌DNA的提取(方法一) 1.实验试剂 (1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS (2)3M NaAc (3)TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA (4)酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1) (5)氯仿:异戊醇(24:1) (6)异丙醇 (7)无水乙醇 (8)75%乙醇 (9)RNaseA 2.实验步骤 (1)取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉 (2)加入4mL提取液,快速振荡混匀 (3)加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本) (4)1000rpm,4℃,5min (5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃离心5min) (6)取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min (7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中 (8)加入1ul RNaseA (10mg/mL),37℃处理1h (9)用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min) (10)取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上 (11)沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃保存备用 二、真菌DNA的提取(方法二) 1.真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉 2.加入3mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次 3.加入1mL 5M KAc,冰浴20min 4.氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min) 5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30 min 6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中 7.加入1ul RNaseA(10mg/mL),37℃处理1h 8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min) 9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上 10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃保存备用 DNA提取缓冲液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巯基乙醇(V/V),PVP和巯基乙醇使用前加入5M KAc 方法一和二,是大同小异。主要是DNA提取液配方不一样!成本也不一样! |
三、真菌菌丝的总RNA的提取 1.实验试剂 (1)RNA提取缓冲液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置),25mM EDTA,0.5g/L 亚精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巯基乙醇(V/V,使用前加入)。由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC处理的水配制即可 (2)SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10mM Tris-HCl pH8.0,1.0mM EDTA (3)10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl,加1‰的DEPC过夜后,高温灭菌 (4)3M NaAc (5)氯仿:异戊醇(24:1) (6)酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1) (7)DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜,高温灭菌 (8)无水乙醇;70%酒精 2.实验步骤 (1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul) (2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀 (3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次 (4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min) (5)取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min) (6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜) (7)10,000rpm,4℃离心20min (8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀 (9)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次,氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min) (10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上 (11)12,000rpm,4℃离心20 min (12)弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥 (13)加200ul的DEPC处理水溶解 (14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量 (在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数) 注意:提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短。 |
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