七、遗传作图相关技术

链霉菌孢子悬液的制备

从已经长好的固体培养基上用棉签刮取孢子，使孢子悬浮于离心管中的无菌水中；将离心管放在振荡器上尽可能地激烈振荡1分钟左右；用装有脱脂棉的试管过滤悬液以除去菌丝片段和固体培养基碎片；3000转/分离心5-10分钟以使孢子沉淀，停止离心后马上倒掉上清液；将离心管在振荡器上振荡几秒钟使孢子沉淀物分散于残存的一点无菌水中；加入无菌的20%甘油于-20℃保存。

链霉菌中NF的证明

链霉菌中的普通致育型因子（NF）能够产生次甲基霉素，能将旁边不携带NF的链霉菌杀死。将待证明链霉菌的孢子均匀的涂布在MS培养基表面，待生长到开始产生孢子和抗生素后，将培养基和表面的链霉菌用枪头制成小圆块，然后接到新鲜的预先均匀涂布了不具有NF的链霉菌孢子MS培养基表面。于30℃培养观察是否产生抑菌圈。抑菌圈的大小代表次甲基霉素的含量。

孢子杂交

杂交试验通常在R2YE上进行，本实验在MS上进行（赵丽云）。首先收获得到两个亲本LY1和LY2大量的孢子悬液，然后分别将两亲本含有108 的孢子悬液混合均匀后涂布在培养基表面 ,于30℃培养直到产生孢子（4-10天）。按照“链霉菌孢子悬液的制备”的步骤收获杂交后的孢子，得到的杂交后代是一系列基因型不同的重组子群。

在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因

1、选择合适的两个亲本：（1）一个亲本带有新基因，另一个不带有，且可用一定的方法区分是否带有新基因。（2）两个亲本具有好几个互补的遗传标记，如一个亲本为his+另一个为his-.

2、将两个亲本进行孢子杂交

3、重组子基因型的鉴定

通常，在特定的选择性培养基上鉴定重组子的基因型，如在亲本（1）pro⁺、his⁺、arg⁺、cys⁺、str^S、ura⁺和亲本（2） pro^-、his^-、arg^-、cys^-、str^R、ura^-这两个亲本菌株-的杂交试验中，首先将杂交后的孢子涂布在一个含有脯氨酸（P）、精氨酸（A）、半胱氨酸（C）、链霉素（S）和尿嘧啶（U）的MM培养基上，因而就选择了从亲本LY2传来的str（链霉素抗性）性状和由亲本LY1传来的his+（不需要组氨酸）性状的重组子。然后挑选重组子菌落，用它们生长用的同样的MM培养基制备母平板，待点种区菌落长成以后，把母平板再影印到一套五种“诊断培养基”上：（1）ACSU（不加P），（2）PCSU（不加A），（3）PASU（不加C），（4）PACS（不加U），（5）PACSU（对照平板）。复制平板经培养以后，每个重组子的基因型根据它们在每种培养基上是否生长而得到鉴定。

4、遗传图谱的制作

本研究挑选了具有str（链霉素抗性）性状和his⁺（不需要组氨酸）性状的重组子172个，然后影印到五种“诊断培养基”上。172个重组子在五种“诊断培养基”上得到生长情况如下：在（1）ACSU（不加P）上生长了40个重组子；在（2）PCSU（不加A）上生长了46个；在（3）PASU（不加C）上生长了54个重组子；但在（4）PACS（不加U）上却未发现有生长的重组；,在（5）PACSU（对照平板）172个重组子都生长了。根据172个重组子在五种“诊断培养基”上得到生长情况制作遗传图谱。

LY1（原养型 Str^S NF SCE25AT bad-M145衍生菌株）（内圈）与LY2（proA1 hisC9 argA1 cysD18 uraA1strA1 NF SCE25AT bad+1258衍生菌株）（外圈）进行孢子杂交，选择具有str^R和his⁺的性状的重组子，其它标记用于计数。

5、在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因

在遗传图谱上两个标记基因之间定位bad基因的过程大致如下：将重组子的基因型与亲本LY1相比就可知，重组子上哪两个标记间的染色体是来源于另一亲本LY2.如果来源于LY2的那段染色体取代了LY1中含有bad基因的一段染色体，那么得到的重组子就不具有bad基因。在松弛培养中，不具有bad基因的重组子中的bldA基因就可被SCE25AT置换掉，从而显示“光秃”表型。结合重组子的基因型就可知bad基因在哪两个相邻的标记之间。