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三、总RNA提取
1)将超低温保存的样品除去样品袋，在电子天平上称重后，转移至用液氮预冷的碾钵中，用杵子碾磨组织，其间不断加入液氮，直至碾磨成粉末状。
2)将碾磨成粉末状的样品，转移至已经加入适量TRIzol试剂的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中，在组织匀浆粉碎机上进行匀浆。匀浆至匀浆液不粘且无颗粒即可。
3)将匀浆液转移至15ml离心管中，于4℃，12000g，离心10min。
4)小心吸取上清液转入新的15ml离心管，在15～30℃放置5min。
5)向匀浆液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，在15～30℃放置3min。
6)于4℃，12000g，离心15min。
7)从离心机中小心地取出离心管，吸取上清至另一15ml离心管。
8)向上清加入异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在15～30℃放置10min。
9)于4℃，12000g，离心10min。
10)弃去上清，缓慢地沿管壁加入75%乙醇5ml，轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小心弃去乙醇。
11)再加入75%乙醇10ml，在涡旋器上短暂涡旋；于4℃，8000g离心10min。
12)小心弃上清，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5min。
13)加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80℃保存。
四、探针标记与杂交
1、预杂交
1)配制预杂交液：杂交试剂1加入到的Eppenderf管中，振荡混匀后，加入杂交试剂2混匀。
2)将配制好的预杂交液放入95℃水浴锅内变性2min，将待预杂交的玻片放入95℃水浴锅内变性30sec，玻片取出后即放入无水乙醇中30sec，晾干。
3)将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5～6hr。
2、标记探针（以下在冰浴中进行）
1)于一已灭菌的1.5mlEppendorf管内依次加入以下试剂（反应终体积为50μl，以下试剂均为RNase-free）：
ddH2O 23μl
逆转录引物5μl
总RNA50～100μg
振荡混匀，置于70℃水浴10min。取出后，迅速置于冰上。
2)分别加入以下试剂：
逆转录酶缓冲液10μl
DTT5μl
dNTPs4μl
3)而后在暗室中加入以下试剂：
逆转录酶2μl
Cy5-dCTP或Cy3-dCTP 3μl
4)用手指弹打管壁以混匀样品，手浴2min。将Eppendorf管置于42℃水浴2hr。
5)依次在Eppendorf管中加入标记试剂I 4μl，65℃水浴10min后加入标记试剂II 4μl。混匀，合并对照组、实验组。避光，真空抽干至50μl左右。
6)使用DNA纯化柱（或乙醇沉淀）纯化DNA。
7)将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀，悬浮内溶的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈，掰断柱下端的密封头。
8)将柱置于一个1.5ml的Eppendorf管中，以3000rpm离心1min将柱置于另一个新的1.5ml Eppendorf管中，去掉顶端的帽，将样品慢慢加到树脂上表面的中间，注意不要搅动柱体。以3000rpm离心2min，经纯化的样品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。
9)加入标记试剂III 8μl，真空抽干。
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