应用流式细胞术（FACS）测定动员后的外周血及采集的自体外周血造血干细胞（APBSC）中的CD₃₄⁺细胞及其亚群，操作简单、快速、重复性好，对及时掌握最佳采集时机，准确判断采集的干/祖细胞数量具有重要指导意义。为准确检测外周血及APBSC中的CD₃₄⁺细胞，本文比较了几种FACS检测CD₃₄⁺细胞方法的异同。

1、材料与方法

1.1　外周血造血干细胞　APBSC采集自经环磷酰胺（CTX）＋重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员后的实体瘤患者（淋巴瘤、乳腺癌），采集使用CS3000- Plus血细胞分离机（Baxter公司，美国）。

1.2　CD₃₄⁺细胞的标记　对10份APBSC分别进行2种不同再处理与CD₃₄标记。
　　1.2.1　溶血法　APBSC与CD₃₄-PE荧光单克隆抗体（Immunotec，法国）室温暗处反应15min，然后用细胞裂解液溶解红细胞，待测。
　　1.2.2　分离单个核细胞法　经Ficoll（相对密度1.007）梯度离心，收集界面层单个核细胞，与CD₃₄-PE标记的单抗室温孵育15 min，待测。

1.3　FACS检测CD₃₄⁺细胞　上述标记细胞悬液分为2管，其中一管6 h内使用流式细胞仪（EPICS ELITE ESP， COULTER公司）测定CD₃₄⁺细胞占单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的百分率，另一管经1%多聚甲醛固定，4℃冰箱保存72 h后，FACS测定CD₃₄⁺细胞数。

1.4　荧光标记的CD₃₄单克隆抗体　33份APBSC同时分别用表达第2类抗原表位QBEnd 10（ClassⅡ，Immunotec）和表达第3类抗原表位8G12（HPCA2，classⅢ，Becton Dickinson）的单抗进行标记，比较2组CD₃₄⁺细胞百分率之间的差异。

1.5　双标记CD₃₄/CD₄₅　APBSC中同时加入抗CD₄₅-FITC（J₃₃）和抗CD₃₄-PE（HPCA2），用溶血法处理细胞，FACS测定CD₃₄⁺细胞。

1.6　统计学处理　用t检验。

2、结果

2.1　溶血法与单个核细胞标记法测得CD₃₄⁺ 细胞百分率无显著性差异（P＞0.50）。

2.2　同一样品经1%多聚甲醛固定72 h后的测定值与6 h内的测定值相比，CD₃₄⁺ 细胞荧光强度降低，非特异吸附增加，变异系数范围在 9.9%～49.5%之间，平均CV值为32.2%。

2.3　APBSC标本分别用2种CD₃₄单体标记，CD₃₄⁺细胞百分率无显著性差异（P＞0.05）。

2.4　CD₃₄-PE/CD₄₅-FITC双标记测定APBSC中CD₃₄⁺细胞的百分率为4.5%，而同一组样品进行CD₃₄⁺细胞单色标记为5.3%。

3、讨论

FACS虽然对CD₃₄⁺细胞的检测具有决定性意义，但早期造血干细胞表面CD₃₄抗原表达弱且少，标本保存（冷冻）、不同标记方法及固定剂的使用均会影响CD₃₄⁺细胞结果。本研究对样品固定前、后测定，CV值明显大于批内变异，应在1%～6%，批间变异＜20%的国际质控标准。样品的2种不同处理方法间虽无显著性差异，但溶血法较分离单个核细胞法简单，避免了细胞损伤，使细胞回收率提高，更适于临床应用。CD₃₄抗原表位可分为3类，其抗原表达亦有差异，应用针对不同表位的抗体测定CD₃₄⁺细胞，结果是否有差异，则报道不一。本研究的结果表明无显著性差异。

各实验室对CD₃₄⁺细胞标记与测定目前尚无统一的标准方法，必然会产生较大的室间差异，Lowdell 等对28份APBSC在15个实验室进行室间分析，结果差异很大，CD₃₄⁺细胞为：0.08%～19.31%，CV值为100.1%～136.6%。1995年初，国际血液治疗与移植工程协会（ISHAGE）成立了干细胞计数委员会，建立了一种简单、快速、灵敏的计数CD₃₄⁺细胞的方法，建议双标记CD₃₄-PE/CD₄₅-FITC计数CD₄₅⁺细胞中CD₃₄⁺细胞的百分率，因为白细胞共同抗原CD₄₅在造血干/祖细胞上的表达明显减弱，CD₄₅和侧向散射光（SSC）一起可以较好地把CD₃₄⁺细胞和淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、血小板团块及有核细胞区分开。此外还可以同时结合第3种荧光抗体，测定CD₃₄⁺细胞亚群。

应用FACS测定CD₃₄⁺细胞应遵循以下原则∶选用特异性及敏感性高的单体，CD₃₄单抗结合PE效果要强于FITC；由于CD₃₄⁺细胞表达很少，应计数尽可能多的细胞，以提高结果的准确性；标本应新鲜测定；同时标记CD45，可提高检测CD₃₄⁺细胞的准确性。