实验原理: 基本同Southern Blotting,但因RNA是单链分子,必须消除局部区域形成的二级结构,在电场中泳动的距离才能反映它本身的大小,因而需使用变性胶进行电泳;操作过程中应特别注意防止RNA的降解。 实验材料: 经检测质量好的RNA样品。 实验步骤: 1.制胶: 2.准备电泳液:1×MOPS buffer(小号槽约配500ml,中号槽约配900ml)。 3.制样:测好浓度后按以下体系加样 4.点样:点样要仔细,不要漏出,并记录点样顺序。 5.电泳:中号槽,电压100V电泳1hr左右,至溴酚兰离点样孔约3.5-4cm(凝胶在紫外灯下可看到28S和18S刚好分开即可)。 6.转膜:转膜液用500ml 4×SSC加27ml 。 7.照相:将胶及膜取下,分别在凝胶成像系统下看胶上RNA是否有残留,膜上RNA效果是否完好。 8.风干:在超净工作台上吹干。 9.固定:于紫外交联仪内以1200 ENERGY照一次约半分钟,再重复一次,再在超净工作台上吹干。 10.杂交:在杂交管内加约50ml杂交液,将膜卷起放入,注意RNA面朝内,于64℃预杂交1-4hr 。 |
11.探针准备:预先挖胶回收的PCR产物或酶切产物(better),测浓度,跑胶验证后,按以下体系加入。 12.探针纯化:在原反应体系中继续加入 13.探针:取出杂交管倒去杂交液,加入15ml杂交液,将探针加入,盖紧,于64℃杂交过夜。 14.洗膜,压片:将杂交管中液体倒出,先加少量洗膜液Ⅰ,冷洗5min,倒出,再多加些洗膜液Ⅰ,冷洗10min,将膜取出测信号,根据信号大小决定是否热洗,若信号高,用洗膜液Ⅱ,Ⅲ继续洗,直到信号值达到适宜值为止,即膜上某一区域信号强,而其他区域信号弱代表杂交上了,然后包膜压片,放于-20℃或-80℃3天左右即可洗X片。 15.结果观察与分析。 |
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