大片段DNA的测序:通过鸟枪法(Shot Gun Sequencing)测序。 鸟枪法测序的操作方法 1. 用限制酶切下目的片段的大片段Insert DNA,,并用Agarose凝胶电泳进行回收。 2. 对回收的大片段DNA用物理方法(如超声波等) 进行切断处理,然后用T4 DNA Polymerase对小片段DNA进行末端平滑化。 3. 进行Agarose电泳,切胶回收1kbp~2kbp的小片段DNA。然后用BcaBest DNA Polymerase在DNA的3’端加上一个A碱基。 4. 把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中,然后转化,挑选克隆。 5. 对阳性克隆(含1kbp~2kbp Insert)进行DNA测序。 6. 对数据进行编辑,最后连成一条大片段的DNA序列。 DNA测序量 应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的6~8倍量进行计算(针对实际片段大小确定测多少倍的覆盖率),对每个反应的有效测序长度定义为600Bases。 如:对100kbp的DNA片段进行测序时,可以按以下方法进行计算: 6倍测序量=100,000Bases×6/600Bases=1000个反应 8倍测序量=100,000Bases×8/600Bases=1333个反应 结果编辑 按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序,然后对其所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段(Contig)。 补缺工作 结果编辑工作结束后,会发现在数个DNA大片段(Contig)间的序列没有测定,此时应该通过primer walking来测序,进行整体DNA序列的补缺工作。 |
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