色谱柱的维护

1、使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）。

2、流动相使用前必须经脱气和过滤处理。

3、避免流动相组成及极性的剧烈变化。

4、大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2～7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围。

5、如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存乙腈中。

6、压力升高是需要更换预柱或冲洗色谱柱的信号。

系统注意事项

1、开、关系统，流速应有缓冲（1ml/min→0.8ml/min→0.4ml/min→0ml/min），以免压力突变致使柱头填料塌陷。

2、流动相是缓冲液系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲液沉淀，这样会导致更大的问题如柱头堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲流动相（即把缓冲液换成水），冲洗5～10个柱体积以后才更换强溶剂。

3、做完测试后切忌直接用100%有机溶剂冲洗柱子，须用90%水-10%有机溶剂（如流动相是缓冲液，应用纯水或含5%有机溶剂-水溶液）冲洗至少30min后，用有机溶剂冲洗30min左右，最后将色谱柱保存在有机溶剂中。

4、更换色谱柱前，须对使用的色谱柱进行冲洗、平衡后，保存在有机溶剂中（最好是乙腈中）。

5、取下色谱柱时，应立即将两端封口。

6、除特殊情况外，一般都应使用预保护柱。

平衡色谱柱的原因

反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的，由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，如不进行平衡，样品中含有的一些盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质和其它一些生物物质很容易与HPLC柱发生相互作用的物质，使这些物质吸附在色谱柱上，使色谱柱污染。

如何平衡色谱柱？

因此在用流动相分析样品之前，我们应先使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果我们所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水“过渡”。平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）。

色谱柱污染后可能出现的情况？

滞留在色谱柱中被吸附的样品成分累积到一定程度足以使他们开始形成新的固定相，有时候这些分析物能与这些杂质作用形成一定的分离机理，这些非目标产物的干扰能被检测器检测到而且能形成色谱峰，气泡，基线扰动及基线漂移等现象，在色谱图上出现“怪峰”，表现为负峰、宽峰、馒头峰、双头峰及前吐舌后拖尾峰和 保留时间会波动。这些行为通常只有通过平行实验才能发现。

色谱柱污染后如何清洗和再生？

当柱子被污染，它的色谱行为和没被污染的柱子会有些不同。被污染的柱子能产生反压问题。 被污染的反相柱子必须清洗和再生才能恢复原来的操作条件。

再生被污染HPLC柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去除。如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的步骤来除去这些污染物往往能恢复其色谱行为。有时候，经过多次操作以后的色谱柱用90～100%的溶剂B（双溶剂反相系统中较强的溶剂）冲洗20个体积可以清除污染物。例如，柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙晴、四氢呋喃。

一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。所用的溶剂都是随溶剂强度增加，经常最后一个溶剂是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烃），可以用来溶解非极性物质如脂质和油类。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。清洗过程要结束时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。例如，异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。冲洗色谱柱时，冲洗液由色谱柱出液端直接接入废液瓶，不能流经检测池，以免检测池被污染。

反相色谱柱没有使用缓冲溶液，请使用以下溶剂系列再生：

100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈-25%异丙醇→100%异丙醇→100%二氯甲烷→100%正己烷→100%二氯甲烷→100%异丙醇→100%乙腈。

反相色谱柱使用缓冲溶液，请使用以下溶剂系列再生：

水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水。

表　用来冲洗的溶剂体积、时间

色谱柱尺寸  柱体积  所用溶剂的体积  冲洗时间
　　150-4.6   2.5ml  50ml   50min
　　250-4.6   4.2ml  80ml   80min

每种溶剂至少冲洗20个柱体积。如250mm×4.6mmHPLC分析柱，可以用1ml/min的流速来冲洗，冲洗后使用没有缓冲的流动相进行平衡色谱柱。

注：如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，说明色谱柱严重污染，冲洗溶剂可以用①0.05M稀硫酸，②二甲基亚砜（DMSO），③二甲基甲酰铵-水（50：50），用低于0.5ml/min的流速冲洗非常有效。