一、原理 细菌体中含有大量蛋白质,具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用,通过加热使蛋白质解离,大量的SDS结合蛋白质,使其带相同密度的负电荷,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上,不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色,可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量,可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液:丙烯酰胺(Acr)29.0g,亚甲双丙烯酰胺(Bis)1.0g,混匀后加ddH2O,37℃溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室温。 三、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置。 (一)聚丙烯酰胺凝胶的配制 1、?? 分离胶(10%)的配制: 2、?? 积层胶(4%)的配制: 将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间,完全聚合需15~30min。 (二)样品处理:将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液,100℃加热3~5min,离心12000g×1min,取上清作SDS-PAGE分析,同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。 (三)上样: 取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。 |
(四) 电泳:在电泳槽中加入1´电泳缓冲液,连接电源,负极在上,正极在下,电泳时,积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止(约需3hr)。 (五) 染色:将胶从玻璃板中取出,考马斯亮兰染色液染色,室温4~6hr。 (六) 脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。 (七) 凝胶摄像和保存:在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像,结果存于软盘中,凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。 四、注意事项 1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。 2、为达到较好的凝胶聚合效果,缓冲液的pH值要准确,10%AP在一周内使用。室温较低时,TEMED的量可加倍。 3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性,可通过皮肤和呼吸道吸收,应注意防护。 |
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