专家姓名：宁进，男
　　单位：Leica公司
　　职称：高级工程师
　　主讲内容：显微镜和图像处理
　　讲课形式：专家答疑
　　其主要围绕以下几点进行答疑：
　　1.常规显微镜的原理及应用
　　2.荧光显微镜的原理及应用
　　3.激光共聚焦显微镜的原理及应用
　　4.图像采集、处理、分析的原理及应用

1.【清风笑】请教：CCD的类型，以及市场上常见的型号、厂家和价格？Metor II型号属于什么档次的采集卡？

【ningjinzhiyuan】关于CCD的选购问题的回复：现在市场上的种类较多，一般各个显微镜厂家都有自己的品牌，如leica的DC和DFC，OLYMPUS的DP80；也有专业厂家的CCD如COOLSNAP和SPOT的；这些CCD有更加细致的具体型号，根据使用的具体情况来选择。如我们做的主要是荧光的观察就需要购买COOLCCD，这种CCD的噪声非常低可以作为弱信号的图像采集，但这种CCD的灵敏度虽高图像的分辨率比较低。如果主要是以比较亮的信号采集为主则可采用高分辨率的CCD。
　　现在我所知道的各个CCD厂家都有自己的图像采集卡（基本上是专用的），而MeteorII也有不同的型号，但基本上是针对市场上的一些通用的模拟CCD的。如sony的Xc-3，jvc的TK-1481等等。

2.【tianxieke】请问IPP（Image-pro Plus）、Leica、Image J，和Adobe类（如Photoshop 、Illustrator）在图像处理和分析上各自的优缺点？

【victoh】我们这比较穷，加上我并不对外文软件感冒，所以我用ImageJ（分windows版和Mac版，另外还有for Mac的NIH Image），它是完全free的，而且不断更新，并不断会有新的plugins（或者更新），它支持绝大多数类型的DC，还可支持QuickTime等；由于其基于Java，占用系统资源较少，不像Photoshop，另外两种基本上没有用过。
　　除作2D图像处理外，ImageJ还可以处理3D照片，分析功能强大，可以统计particle的数量、直径、颜色比例等，当然分析Western Blot、SDS-PAGE等不在话下，前几天还出了个Dot blot分析的应用介绍。
　　使用Image J的话，建议1周左右就去网站上兜兜，看看有没有程序更新、新的Plugins或更新。

3.【大懒猫】想知道一些关于用Image J测灰度的问题，不知道能不能讲讲？

【victoh】请从dingxiangcell3@yahoo.com.cn下载PDF格式的Image J Manual（由WinRAR分成2卷，请用WinRAR4.0以上解压），信箱密码为dxcell20041215。

4.【小卫】想请教下leica Qwin可不可以测光密度，上次听一个工程师说不行，如果不行要怎么处理呀？

【zhaoqingshan】必须用Leica专门的光密度的率光片定标后，才可以检测的。

【ningjinzhiyuan】Leica的QWIN软件有四个版本从低到高是：Lite、Plus、Standard、Professional如果进行光密度的测量需要Pro版，硬件的确需要可校准光密度的标准灰度率片。

5.【hailili】请教利用LEICA Qwin II图像分析软件分析图像中的阳性结果面积，如何解释给出结果项目Intercept H、Intercept V、Perimeter、Count、Area Fract、Anisotropy 、Area Fill 、Mean Chord 、Area%、Count/Area？

【ningjinzhiyuan】你好，在斑竹提供的下载PPT文件中有比较详细的描述。我会在近期上传一个Qwin的中文说明供大家参考。

6.【sunwj】可以在这儿留言吗？我们科的Leica DM IRE2据工程师讲可以做显微注射，我挺感兴趣，请问公司可否派人来示范操作呢？
　　还有，我们拍细胞时，明明目镜下看的很好，可电脑上抓拍时感觉用photoshop画的似的，色彩非常假，一点也不自然，我们猜可能是处理软件没有调试好，尤其是色彩对比度方面，我们shading了也没用，请问工程师可以来帮我们重装软件吗？现在非常急用，因为同样的问题，我们的正置显微镜也没法用，非常希望您能来帮我们处理。
　　另，该图像处理软件可以对胶原海绵进行图像分析吗？比如测量表面孔径大小？

【ningjinzhiyuan】Leica DM IRE2是一款研究级倒置显微镜；如果需要进行显微注射需要有微分干涉的部分。有些CCD在抓拍时可能需要调整gama值，而Shading是用来调整由于照明不均匀而带来的固有噪声与颜色无关。

7.【yannantian】希望宁工讲一下，荧光显微镜的操作，我们实验室的总是用的不顺！！！

【ningjinzhiyuan】的确这个题目可能太大了，因为现在大家所用的荧光显微镜分为不同的品牌，而且同一品牌的也有不同的档次，各有不同的使用技巧。一般来说使用荧光显微镜要注意以下几个方面：
　　1、汞灯一定要调好，因为大部分荧光信号较弱，所以调好照明非常重要；一般的汞灯分为50w和100w，一定要注意区别；一般调好的汞灯既要明亮又要均匀。这里有一些土办法来测试：用大家的身份证可以作为测试的样品（上面有荧光，而且比较均匀）。
　　2、选好合适的激发滤片组合。请大家注意滤片分类。有BP带通，LP长通，一般的带通比长通的要昂贵，效果也会好一些；
　　3、选择合适的物镜；一般来说在观察荧光信号时物镜的档次越高越好，因为档次越高数值孔径越大收集光线的能力越强；但有时大数值孔径的物镜的工作距离较短，尤其是高倍物镜，所以如果用厚底的器皿就只能选择长工作距离的物镜。

8.【wyx0709】请教宁工：我的荧光染色的片子染色很好，但是用荧光显微镜看一会荧光明显减弱，拍照后更为显著，是不是荧光灯太亮了，应该调弱一些？
　　我染的是细胞核（蓝色），胰高血糖素（绿色），胰岛素（红色），尤其以照细胞核（非常明亮）后衰减的利害（片子上出现大黑斑），我试着换到蓝色后赶快照相以减少接触光线的时间，但是这样拍的照片模模糊糊（好像照相时片子移动了一样），必须等3、5秒钟之后拍摄才会清楚，请教这是为什么，有何解决的办法？

【ningjinzhiyuan】我曾经提到过荧光淬灭的问题，我想你可能就遇到了这个问题。照细胞核使用的是DAPI（我猜想）用的是紫外激发是最容易淬灭的。另外我建议采荧光信号最好用专用的CCD灵敏度比较高，拍摄时间短可以减少震动引起的模糊。

9.【blueflute】请教宁工，我们实验室有一台相差显微镜，照相总是觉得光不匀（背景呈花斑状，但并不是视野内一边亮一边暗），好像调整光轴的效果不大。有没有什么调整的办法吗？

【ningjinzhiyuan】对于相差显微镜的调节的第一部是科勒照明的调整；大部分问题都处在这里，还有就是相差环的中心的调整。我不知道你所说的光轴调整是包括什么。
　　有关科勒照明是显微镜的一个基本的调节，其中包括视场光阑和孔径光阑的调节。的确相差环的调节就是把它调到中心，但一般要用到一个叫调焦望远镜的工具才能看到聚光镜端的相差环。

10.【西瓜】请问leica与metamorph图像分析软件有联系吗？

【ningjinzhiyuan】没有。

11.【西瓜】请问莱卡有没有数码单反，可以连接到显微镜的？

【ningjinzhiyuan】leica是三个集团共用的一个品牌，照相机集团和显微镜集团不是一家。据我所知Leica没有数码单反。但最近有一款数码相机推出（不是单反）。

12.【dongling1980】宁工你好，为什么我在显微摄影装置中的照相机下方的那个镜头看不到视野呢？黑的一片，但是在显微镜的目镜中可以很清晰的看见啊，我应该调哪个装置呢？

【victoh】装置上有一个光路切换拉杆，一般有三档，分别是：目镜、照相机、混合；您可能没有切换。

13.【清风笑】请问宁工，Leica公司产双光子共聚焦显微镜吗？单光子、双光子共聚焦显微镜和普通共聚焦显微镜有什么区别，主要优势是什么？

【ningjinzhiyuan】Leica有双光子共聚焦显微镜，单光子即普通共聚焦显微镜，双光子是利用一种特殊的脉冲激光器进行激发；由于双光子共聚焦显微镜也是进入实验室不久的一个产品，它的应用主要集中在对于脑片、神经的研究。主要特点是光毒性小，穿透能力强。

14.【thp12933】我的切片染色效果不是太理想，有没图像处理的技术可以优化一下呢？

【victoh】一般来说，前期工作最重要，后期通过软件处理较为困难，当然稍微优化一下还是有可能的，所以还要看具体情况。

15.【echo9450627】请问宁工，我用的是Lecia的pro版。光密度是不是可以通过灰度的测定来推出光密度吗，是不是有什么公式呀？

【ningjinzhiyuan】光密度的测定必须有标准的光密度玻璃片进行校准才可测量，不能用灰度来推。因为光的线性不好。

16.【tianxieke】请问，宁工，Leica显微镜调节相差时有一个叫做“博士镜”（可能我写错了，音同）的到底是什么东西？

【ningjinzhiyuan】英文是Bertrand Lens，实际上是一个望远镜（可调焦），是把在正常情况下目镜中不可成像的相差环成像的一个装置，用来调相差环居中的；在地质上有另外的用途（锥光片光）。

17.【浪漫一身】我有个问题：在使用confocal microscope时，会不会有些细胞未加荧光染色，也会产生极小的绿色荧光颗粒，即细胞本身会发现很多荧光颗粒，造成假象。比如某些肝细胞。请问是什么原理呢？是显微镜的原因还是细胞本身的原因？我用的是PI染细胞核，但会出现很小很小绿色的颗粒（就是把那个绿色扫描的开的非常大），他们管显微镜的告诉我是假象。

【ningjinzhiyuan】请问你一般用什么染料，还是用的GFP。一般如果没有染色而且样品洗得很干净不应出现假象。
　　据我所知PI的特异性不是特别好有的时候会进入细胞的胞浆中；而且PI的信号应该是红色的而不应由绿色信号。

18.【prcno1】请问宁工：数码显微照相真实放大倍数如何计算？

【ningjinzhiyuan】一般我们是利用测微台尺进行校准（一般的CCD相机有自己的放大，无法进行计算）。

19.【西瓜】能否讲一下光密度定标的原理，及为何必须要用光密度片定标。不定标的话，是否不能用光密度这个参数？

【ningjinzhiyuan】原理可能比较复杂，这里时间有限。但大家应该了解到的是光的线性度不好只能利用差值的方法去逼近。光密度片就是这个原理，如果不定标，就不能用光密度这个参数。

【西瓜】这个还是很重要，有些软件不经过校正直接就生成光密度，那么，是否这样的软件就不能够用了。还有，光密度片可能再一定程度上可以使得光密度值可靠些，但每次都要使用还是有些麻烦，在使用过程中，肯定有不少注意事项。不知leica有没有这方面相关的资料可以查阅的，还有leica的光密度片的标准是否大家都认可？

【ningjinzhiyuan】就我所知光密度的测量是非常麻烦的。必须保证实验条件的稳定（也就是照明的条件不能有改变；因为OD值是一个绝对值而不是一个相对值）。我们所采用的校准用的片子是一些标准厂生产的，不是Leica自己生产的。此标准也是大家通用的。不是Leica制定的。

20.【西瓜】莱卡在上海好像有个合资厂，我们以前买过教学用的显微镜，感觉质量不好，不知现在怎样？

【ningjinzhiyuan】是的，教育用的显微镜是上海生产的。我们一直负责进口的设备，所以接触的不是很多，无法做出评价。

21.【清风笑】宁工，Leica同一类型的显微镜也需要分别定光密度的标准吗？不可以借用或者拷贝一下文件，然后定标吗？

【西瓜】估计不行，应该是每批都的定标的。感觉是件麻烦事，但不知道麻烦是否值得。

【ningjinzhiyuan】每一次测量需要定标一次。所以无从拷贝文件。

21.【prcno1】我们的CCD是0.6的，如用10倍物镜，如何写放大倍数？写成10X10是否对？如不对，一般论文中的10X10如何解释？

【ningjinzhiyuan】我们的很多图像一般只标出使用的物镜的倍数。因为CCD尺寸是0.6的，如果每一个像原的尺寸可以使6.7微米也可以使3.75微米，那么你所采得的图像的分辨率就不同。图像放大到同样的尺寸会有不同的放大率。

【prcno1】我明白了。我们再采集图像时，如能加上拍摄此倍数下的定标标尺那才是最好的了？

【ningjinzhiyuan】是的。

22.【prcno1】我们做荧光成相时，如荧光较弱，相机会自动延长曝光时间抬高本底进行成像，分析时如何比较荧光强度？只简单地减去本底光密度是否可以？这种方法我认为不妥当。

【ningjinzhiyuan】如果你是采用的胶片相机进行拍照然后扫描，那么我建议你采用同样的曝光时间设置；在Leica的MPS60中可以用一种一次测光后以后用此设置照相的方法；CCD的方法也一样，保证同样的曝光时间（积分时间），同样的灵敏度（有的CCD是可以调节的）。

23.【guyuebugu】我们的万能显微镜配备的CCD是单色的，每次照相要用三色合成，经常颜色会失真，请问如何解决这个问题？

【ningjinzhiyuan】你是照荧光图像吗？

【guyuebugu】不是照荧光，是照普通光源染色切片。

【ningjinzhiyuan】是用的Spot的CCD吗？

【guyuebugu】我也不知道是什么CCD，只知道要用红、绿、蓝照三张，然后合成才能得到彩色的图片。每种颜色照的时候曝光时间不同合成的图片颜色就不一样。

【ningjinzhiyuan】是的。但一般这种CCD都提供不同的拍摄模式，如荧光、明场等可以选择。

【西瓜】单色的CCD属于比较高级的，解决方法也简单，测光后，固定曝光时间就可以了。

24.【astra】宁工，您好，我们实验室有一台荧光显微镜，只有蓝光和绿光，但我们实验经常用的是紫外激发，请问能用这台显微镜么？如果不能，这台显微镜可以改装成带紫外区的吗？

【zhaoqingshan 】您可以配上紫外激发的滤光片就可以了，您的显微镜是什么型号的？

【astra】谢谢，我记不太清了。好像是OLYMPAS-540。

【zhaoqingshan 】补个滤光片吧，找OLYMPAS的技术支持。