高速逆流色谱属于逆流色谱的范畴，逆流色谱是新型的分离手段，它的主要分离原理是利用样品在固定相和流动相之间的差异也就是分配比不同而进行分离的，值得注意的是逆流色谱的固定相和流动相都是液体，其主要优点是没有传统色谱的死吸附，样品的回收率高等特点。

逆流色谱源于逆流分溶法，也就是用实验室经常使用的分液漏斗进行连续的液液萃取，根据样品在两种互不相溶的溶剂中分配比不同而进行分离。

逆流色谱早期发展的方法有液滴逆流色谱，旋转小室逆流色谱等。但是作为一种分离手段，早期发展的逆流色谱不能满足高效快速的分离，分离的周期很长，效率很低。

在70年代，Ito博士成功开发了一种能够高效快速分离的逆流色谱-高速逆流色谱（HSCCC）。但高速逆流色谱也有很多种设计，经过几十年的发展，现在的高速逆流色谱一般是采用同步行星式的设计，其主要是利用在高速旋转状态产生的二维离心力场的作用下使两种互不相溶的溶剂快速有效的对流或分割——或者说混合或分层，从而使样品能够在短时间内进行成千上万次萃取，根据样品中的物质分配系数的不同而进行分离的一种方法。

HSCCC有几个突出优点：

（1）无不可逆吸附。聚四氟乙烯管中的固定相无需载体液-液色谱系统，故而消除了气-液和固-液色谱中因使用载体而带来的吸附现象，特别适于分离极性物质和生物活性物质；

（2）高回收率。由于流动相和固定相均为液体，样品可全部回收，分离纯化与制备可同步完成，故特别适于制备性分离；

（3 ）操作简便。因固定相为液体，体系换与平衡方便、快捷。与HPLC相比，HSCCC进样量较大，最多可达数克，是HPLC的数百倍；与常压、低压色谱相比，HSCCC的分离能力强，有些样品经一次分离即得到1个甚至多个单体，且分离时间短，数小时即可完成，纯度多在98%以上。

高速逆流色谱作为一种比较新颖的分离方法，影响因素主要有溶剂体系的选择，旋转速度，流动相的流速，温度等影响。溶剂体系选择即条件的摸索，相当于传统色谱摸流动相的条件，不同的是高速逆流色谱条件的摸索主要是指样品在固定相和流动相两者之间的分配的比值，待分离的样品的K值最好在0.6～1.5范围之内，样品才会有一个好分离效果。转速主要体现在固定相的保留率上，一般转速越高固定相保留率也比较高，分离效果也相对的好一些。流速要适中，太大会降低固定相保留率，太低会容易拖尾。温度是一个非常重要的参数，温度恒定对体系的重复性有着决定性的影响，比如说冬天，夏天可能同一个溶剂体系就会有着不同的分离效果。

高速逆流色谱在药物领域主要应用在中草药，合成药物，抗生素以及蛋白等领域。在天然产物中应用的更广泛一些，比如生物碱、黄酮、香豆素，蒽醌，皂苷，萜类等都有相应的研究。对于每一类的化合物一般都有一些经典的体系，比如说生物碱用氯仿：甲醇：水（酸水），或者用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水。在低极性的化合物象挥发油，萜类可以用正己烷：甲醇：水，石油醚：甲醇：水等体系，皂苷一般用乙酸乙酯：正丁醇：水体系。

以上介绍了选择溶剂系统的一般步骤，主要是查文献-摸索条件-上高速逆流主机-筛选优化体系这几个步骤。摸索条件和上机做实验是最关键的。其实每一类型化合物都有一些比较固定的体系，比如说生物碱类化合物你可以用氯仿：甲醇：酸水的体系，也可以用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水的体系，还有人用正己烷：正丁醇：水的体系成功分离了石杉碱甲。具体哪个体系适合，就要看样品的具体性质来判定。摸索体系对于初学者可能会比较慢，但是慢也不是一件坏事，毕竟是一个经验积累的过程。

摸索条件主要是判断要的组分的分配系数如何，一般会选在一个比较合适的位置，（0.6～1.5）我们可以通过把体系加入试管当中，然后加入样品，观察上下相的颜色，最好在通过薄层看一下斑点大小（取等量的上下相点板）。

值得注意的事，选择体系的时候一般要注意最好先选择比较经典的体系或者固定相的保留率高的体系（判断的一个标准就是上下两相的比重相差越大，保留一般就会高，最好拿个试管看所选体系的分相时间，最好是小于30秒）比如说氯仿：甲醇：水=4：3：2，正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水=1：1：1：1，乙酸乙酯：正丁醇：水=4：1：5体系。氯仿：甲醇：水系统比较适合中等以上极性物质的分离，如果是酸水的话还可以用来生物碱的分离。正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水适合分离低、中等极性的物质，根据化合物不同极性作比例的调整。乙酸乙酯：正丁醇：水主要用一些极性比较大化合物的分离。在选择体系的时候也要注意上下相的比例，一般都是采用轻相做固定相，如果所选择体系上相很多，下相较少的话，就会比较浪费。

关于体系的优化就是为了寻求一个更好的分离效果，这个相对来说比较容易些，可以根据选择的体系进行比例的调整或者在加入少量的其他溶剂，主要手段就是为了寻求一个更合适的分配系数。除了体系的调整以外还可以进行流速和温度的调整来选择一个比较合适的溶剂系统。

以下是一些网友问题的解答及经验总结：

1、问：分离皂苷时用的什么溶剂系统，什么检测方式呢？

答：我用的是乙酸乙酯：正丁醇：水的体系，连接的检测器是ELSD，像有些皂苷类，甾醇类的没有紫外吸收的，我们一般用ELSD检测器。

分离一些水溶性的物质，我们会加入一些正丁醇，由于正丁醇本身的粘度比较大，所以体系会有一些不稳定，我们一般会把流速降低来增加体系的稳定性以求获得好的分离效果。

如果水溶性更大的，我们可以在体系当中继续加少量的甲醇，来获得一个满意的分配系数。当然分离水溶性的物质我们也可以采用氯仿甲醇水的体系，这个时候甲醇的量应该是比较大的，我看过有体系用氯仿甲醇水分离过黄酮苷类的物质，如果分离效果还不是很明显的，就是说分离物质在氯仿层的溶解度不是很大的话，我们也可以在体系中加入一些少量的正丁醇，调整一下分配系数，这样就会有一些好的分离效果.当然甲醇有的时候也可以换成乙醇，有的时候用乙醇能获得一个比较好的分离效果。

其实丙酮也能用来分离，但是如果用紫外检测器的话，可能丙酮由于末端吸收会干扰物质的信号在逆流色谱当中用的不是非常多。如果用的检测器是ELSD的话这样丙酮就可以使用。

2、问：HPLC的泵、检测器是否可以和HSCCC联用？主要要考虑的因素是什么呢？

答：HPLC的泵理论上是可以跟HSCCC连用的，但要注意，由于HPLC的泵是耐高压的，而HSCCC所用的管材是塑料的，经不起高压，所以在联用的时候一定要注意，不要让管路堵塞了。另外要注意HPLC的泵在不接柱的情况下的泵压，我曾见过有人用安捷伦的泵接HSCCC，结果爆管了，一检查，泵一工作压力就有4MP。

HPLC的检测器与HSCCC的联用有如下问题要注意，HSCCC上的样品较杂，我们知道，HSCCC的管路直径有1.5厘米，有些许不溶物进入管路不影响分离，但HPLC检测器流通池的容积只有5～8微升，这样就有堵塞的可能，一旦堵塞，要么爆管，要么爆流通池。

另外HSCCC所用的试剂都是AR的，用HPLC检测器检测灵敏度太高，而HSCCC分离的样品量也较大，HPLC的检测器的量程可能不够。还有就是HSCCC所用的两相溶剂，在运动过程中产生剧烈的混合，因而溶剂不可避免的要产生一些乳化，甚至会产生一些流失，这样HPLC检测器得到的图谱会非常的难看。

3、经验：高速逆流色谱在医药领域的使用范围，总结一下有：

（1）中药领域（应用比较广泛，生物碱，黄酮，香豆素，糖苷等分离较多，水溶性很大的物质报道的不多）。

（2）抗生素领域，有相关的文献报道（据我了解，已经有些人在这方面做了很多的研究）。

（3）蛋白质类物质，双水相体系分离用逆流色谱分离的文献报导不多。

这种分类其实是不完全的，因为分离可以应用到很多方面，比如说分离药物代谢产物方面也是一种方向。

逆流色谱对于制备分离内源性物质也有着自己的优势。因为本身的代谢产物含量少，富集分离困难，高速逆流色谱由于具有高回收率等，样品预处理简单等特点，能够快速的富集到相应的产物，然后再作进一步的分离。