一、概述

T7 DNA聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及单链和双链3'→5'外切酶活性。当T7 DNA聚合酶用适当方法处理后，可使3'→5'外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA聚合酶又称T7测序酶。使用T7测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此, 放射自显影所得到的结果较为清晰易辩，对于许多模板来说，使用含有dGTP的混合物即可得到理想的测序结果。然而，如果出现了带压缩的问题，则用含dITP的混合物来取代常规的dGTP。dITP的掺入，使在富含GC的模板中也能有效地消除带压缩现象。

T7测序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延续性，正因如此，该酶在使用中不同于Klenow片段和反转录酶。它几乎没有错误性的终止，整个反应在很短的时间内完成，并且不需要进行追加反应（Chase step）。然而对于有紧密二级结构的区域，错误的终止反应会给阅读序列带来困难。如果碰到这些情况，应使用一些高温DNA聚合酶，如Promega公司的测序级Taq DNA 酶。利用高温DNA聚合酶独有的耐热特性，测序反应可在不利于形成二级结构的高温条件下进行。

T7 DNA聚合酶测序的快速而简便的方法是从Klenow酶和AMV反转录酶测序的操作步骤修改而来的，它的最大优点是具有很高的5'-3'的DNA合成活性和极低的3'-5'端外切酶的活性。在测序过程中，若以同位素标记则相对于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段Klenow，或反转录酶AMV而言，则可使条带非常的均一，并且它的放射性背景极低。

T7 DNA聚合酶测序时DNA的合成的过程是分二步完成的。第一步为标记反应阶段，第二步方为双脱氧链末端终止的DNA合成过程。在第一步过程中，引物的延伸是在较低浓度的脱氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反应过程中，已含有经放射性标记的dATP。第二步过程中，脱氧三磷酸核苷酸浓度提高，并且加入双脱氧的三磷酸核苷酸，DNA 在合成过程中，因加入的双脱氧三磷酸核苷酸而随机终止，形成长短不一的DNA片段。

二、材料

待测的DNA模板，可用双链或单链模板。

三、设备

高压电泳仪，测序用电泳槽，照相显影用大号塑料盆，制胶设备，吹风机，放射自显影盒，X光片。

四、试剂

1、5×T7 DNA聚合酶缓冲液：200mmol/L Tris·Cl，pH7.5，100mmol/L MgCl₂，250mmol/L NaCl。

2、引物：使用通用引物pUC/M13正向或逆向引物。

3、DTT：0.1mol/L。

4、5×常规标记混合物：7.5mmol/L dGTP，7.5mmol/L dCTP，7.5mmol/L dTTP。

5、5×dITP标记混合物：15mmol/L dITP，7.5mmol/L dCTP，7.5mmol/L dTTP。

6、dNTP A溶液（适用于dGTP）：80mmol/L dGTP，80mmol/L dATP，80mmol/L dCTP，80mmol/L dTTP，50mmol/L NaCI。

7、ddG终止混合物（适用于dGTP）：dNTP A溶液再加8mmol/L ddGTP。

8、ddA终止混合物（适用于dGTP）：dNTP A溶液再加8mmol/L ddATP。

9、ddT终止混合物（适用于dGTP）：dNTP A溶液再加8mmol/L ddTTP。

10、ddC终止混合物（适用于dGTP）：dNTP A溶液再加8mmol/L ddCTP。

11、dNTP B溶液（适用于dITP）：160mmol/L dITP，80mmol/L dATP，80mmol/L dCTP，80mmol/L dTTP，50mmol/L NaCl。

12、ddG终止混合物（适用于dITP）：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddGTP。

13、ddA终止混合物（适用于dITP）：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddATP。

14、ddT终止混合物（适用于dITP）：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddTTP。

15、ddC终止混合物（适用于dITP）：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddCTP。

16、测序用T7 DNA测序酶。

17、酶稀释缓冲液：10mmol/L Tris·HCl，pH7.5，5mmol/L DTT，0.5mg/ml BSA 。

18、终止溶液：95%甲酰胺，20mmol/L EDTA，0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯兰。

19、[a-³²P]dATP 或[a-³⁵S]-dATP，³⁵S的优点是可使条带为窄而清晰，并且操作更为安全。放射强度为：1000～1500Ci/mmol，10mCi/ml。

20、TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH7.5。

21、上节所述的凝胶制备过程中的全套试剂。

22、X光显影液：H₂O：50℃ 800ml，米吐尔 2.2g，无水Na₂SO₃ 72g，对苯二酚 8.8g，无水NaCO₃ 48g，KBr 4g， 定容至1000ml备用。

23、F-5坚膜定影液：水600ml，Na₂S₂O₃ 240g，Na2SO₃ 15g，冰醋酸 13.4ml；硼酸 7.5g ，粉状钾矾 15g ，定容至1000ml 备用。

24、TYP肉汁培养基：16g蛋白胨，16g酵母提取物，5g NaCl，2.5g K₂HPO₄，加水溶解，定容至1000ml。

25、20%PEG/3.75mol NH₄Ac 溶液：40% PEG（分子量8000）储备液和7.5mol/L pH7.2 NH₄Ac储备液等体积混合。

五、操作步骤

（一）模板制备
　　
1、M13单链模板制备：

在转化入合适的大肠杆菌宿主菌且在含有指示剂如X-gal/IPTG的培养基上铺板之后，含有M13重组子的细胞将表现出无色的“噬菌斑”，事实上受感染的细胞并非被噬菌体溶菌或杀死，出现噬菌斑是因为被感染的细菌在生长速度上比其周围未感染的细菌慢的缘故，从无色噬菌斑上得到的感染细胞经培养便能产生测序反应所需的单链模板。

（1）过夜培养的宿主细胞（如NM522或JM101）用3ml TYP肉汁培养基以1：100稀释。在37℃强烈震荡1小时之后，细胞进入对数早期。此时，将一个合适的含有重组M13的噬菌斑（连同琼脂）用滴管转入该细胞培养液中。

（2）37℃强烈震荡（300rpm）培养6小时。

（3）把细胞培养液转入两只1.5ml eppendorf管，12000g离心15分钟。上清液转移到新的eppendorf管再离心15分钟。小心地取出1～1.2ml上清液（注意不能触及沉淀），再转到新的eppendorf管。

（4）将0.25体积的含20%PEG（-8000）的3.75M醋酸铵（pH7.5）加入上清液以沉淀噬菌体。混匀后置冰上30分钟，再以12000g离心15分钟，倾去上清液，再以同样方法离心一次，用吸液器尖头将残留的PEG充分吸干净。此时应能见管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。

（5）将沉淀物重溶于400ml TE缓冲液中。

（6）加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混合液，强烈震荡1分钟，12000g离心5分钟。

（7）将水相转入一新的eppendorf管，注意不能触动原管中两相交界面。加等体积苯酚/氯仿（1：1）混合液，强烈振荡1分钟，12000g离心5分钟。

（8）将上层水相转入另一新的eppendorf管，重复第7步的提取，如有必要重复多次直至二相之间无可见物质存在。

（9）将上层水相转入一新的eppendorf管，加等体积氯仿，强烈振荡1分钟后，12000g离心5分钟，多次重复此步骤。

（10）将上层水相转入新的eppendorf管，加0.5倍体积的7.5 mol/L醋酸铵，2倍体积乙醇，混匀后-20℃放置30分钟。

（11）12000g离心15分钟，去除上清液，用70%乙醇小心清洗沉淀，如果沉淀已被搅起，重新离心，倾去酒精，真空干燥沉淀物。

（12）将DNA的沉淀物溶解于20ml去离子水中，取2ml样品进行琼脂糖凝胶电泳定量，如果DNA量充足，则可进行退火测序。

2、噬粒（Phagemid）单链模板的制备：

噬粒是指含有丝状单链DNA噬菌体复制区的嵌合质粒。分子克隆中常用的pBluescript系列和pGEM系列的质粒均属噬粒。含重组噬粒的细胞单菌落经液体培养并用辅助噬菌体超感染后就能产生测序反应所需的单链DNA模板。

（1）从新鲜平板上挑得含pGEM质粒DNA的抗Amp单菌落，并接种到100ml含有50mg/ml氨苄的TYP肉汤培养基中，在37℃振荡过夜

（2）取100ml过夜培养物接种到另一新的装有5ml含50mg/ml Amp的TYP肉汁培养基的试管中，在37℃强烈振荡30分钟。

（3）加40μl辅助噬菌体R408或M13 K07，继续剧烈搅拌振荡培养6～8小时，使辅助噬菌体超感染。

（4）12000g离心15分钟后，去除沉淀，取上清，转移到一新eppendorf管中再次离心15分钟，小心地取1～1.2ml上清液（注意不能触及沉淀）。

（5）将0.25体积的含20%PEG的3.75M醋酸铵加入上清液以沉淀噬菌体颗粒。混匀后置冰上30分钟，再以12000g离心15分钟，倾去上清液，再以同样方法离心一次，用移液器尖头将残留的PEG溶液吸净。此时应能看到管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。

（6）将沉淀物溶解于400ml TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA）。

（7）加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混合液，强烈振荡1分钟，再以12000g离心5分钟。

（8）将水相转入一干净eppendorf管（不要触动原管中两相交界面），加等体积酚/氯仿（1：1）混合，强烈振荡1分钟，12000g离心5分钟。

（9）上层水相转入一干净eppendorf管重复第8步骤提取，如有必要重复多次直至二相之间无可见物质。

（10）将上层水相转入一干净eppendorf管加等体积氯仿，强烈振荡1分钟后离心，多次重复此步骤。

（11）将上层水相转入一干净eppendorf管加0.5倍体积7.5mol/L pH7.5醋酸铵，再加2倍体积乙醇，混和后-20℃放置30分钟。

（12）12000g离心15分钟，去除上清液，用70%乙醇小心清洗沉淀，如沉淀已被搅，重新离心，倾去乙醇，真空干燥沉淀。

（13）将沉淀物溶解于20ml去离子水中，取2ml样品进行琼脂糖凝胶电泳进行定量，如果DNA量充足，则进行退火和测序。

3、质粒膜板制备：参照第一章所述的方法。

（二）超螺旋质粒DNA的碱变性

1、取4mg（约2pmol）超螺旋质粒DNA至一eppendorf管中，加无离子水到终体积18ml。

2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液，置于室温（25℃下）保温5分钟。

3、加2ml 2mol/L NaAc溶液（pH4.6）涡旋混匀，使之中和。

4、加75ml无水乙醇，充分混匀后，置于干冰或-70℃沉淀10分钟。

5、于12000g离心10分钟，弃去上清，用200ml预冷的70%乙醇洗沉淀后，干燥沉淀，溶于20ml无离子水中。

（三）测序反应

1、引物和模板的退火：

（1）在一离心管中，混合如下几种试剂：

引物 约1～2pmol

5×T7 DNA聚合酶测序反应缓冲液 2ml

DNA 约1mg

加ddH₂O终体积至10ml。

（2）将试管盖盖上后，65℃加热2分钟，然后在大约30分钟左右的时间内，使试管的温度缓慢地降到室温。降温的过程中可使用小的加热板或小型的保温仪，也可使用已调至65℃的水浴，使它们的温度在室温下缓慢地降至室温即可。当温度降至30℃以下时，退火结束。可将小试管置于冰上，退火完毕的模板须在4小时内使用。

2、标记反应

（1）在一个标准的反应过程中（从引物处开始，可读到500个碱基以上），首先需要按1：5稀释标记混合物。如4ml混合物则加双蒸无离子水16ml。该稀释液储存在-20℃可使用数周。如果所要测定的序列小于30个碱基，可将标记缓冲液稀释15倍，同时，模板DNA要高于0.5pmol。由于DNA模板量的不足，会降低标记反应的程度，即只标记引物后的几个核苷酸。

（2）用冰预冷的TE缓冲液按1：8稀释T7 DNA聚合酶。酶液稀释后应立即使用，置于冰浴不宜超过60分钟。不得使用标记混合物、DTT溶液或非缓冲液类溶液稀释酶液。

（3）在已退火的引物-模板混合物中，依次加入：

0.1mol/L DTT 1.0ml

标记混合物 2.0ml

[a-³⁵P]dATP或[a-³⁵S]dATP 0.5ml

已稀释好的T7 DNA聚合酶 2.0ml

混合充分（注意不得产生气泡），置于室温5～10分钟。

如果在电泳时碰到带压缩问题，则dITP混合物的效果优于dGTP混合物，dITP混合物的使用方法与dGTP混合物的使用是相似的。

【注意】

1、稀释时应将所有的溶液预先混合完全后再加入酶液。

2、在第（3）步的过程中，如果反应中有几次冷却，保温的时间过长或温度太高的话，则会使测序反应短于100个碱基。

3、链终止反应：
　　（1）取4支eppendorf管分别标上G，A，T，C。
　　（2）每个管分别加入2.5ml G，A，T，C链末端终止混合物，立即盖上盖子以防液体蒸发（本反应最好在标记反应前做好）。dGTP和dITP混合物依据各自需要选用。
　　（3）将eppendorf管预热至37℃1分钟。
　　（4）待标记反应完毕后，取3.5ml标记反应液至上述4支eppendorf管中，稍微离心一下，并将上述四管置于37℃保温。注意在每一次反应中，均应使用新的吸液头，以免交叉污染。
　　（5）继续保温3～5分钟（若使用dITP时，保温时间可延长至30分钟，对反应产物没有任何影响）。
　　（6）在上述四管中各加入4ml终止缓冲液。混合均匀后，置于冰浴中。本样品即可上样电泳。用³⁵S标记反应的样品可置于-20℃保存一周，此时样品只有极少量的降解。而³²P标记的则需在当天电泳以免降解。

（四）测序凝胶板的制备及电泳

参考第一节测序凝胶板的制备及电泳部分。样品加热至75～80℃ 2分钟，立即上样，每个泳道的使用量为2～3ml。

（五）测序凝胶板的干燥及放射自显影

电泳完毕后，经³²P或³⁵S标记的产物可用对b-射线敏感的X光胶片放射自显影检测。

1、取下电泳的玻璃板，去除两边的压条，用小的薄钢片撬开玻璃板。若玻璃板用粘合硅烷处理过，凝胶会紧紧地粘合于玻璃板上，则凝胶与玻璃板一起进行下面步骤的处理。如果玻璃板没有经过粘合硅烷的处理，则可用3MM大滤纸贴在有凝胶的玻璃板上，小心地揭下凝胶，准备下一步的处理。

2、去除尿素，将含有凝胶的玻璃板或滤纸浸于含有2升10%冰醋酸的大号显液盆中，轻轻振荡15分钟，去除尿素。

3、干胶：含有凝胶的玻璃板可用电吹风吹干，而含有凝胶的滤纸则可用专用的干胶设备如真空加热干胶仪抽干。

4、已经干燥的凝胶即可进行放射自显影。在玻璃板含有凝胶的这一面加上X光片后，用另一块相似大小的玻璃板夹住，然后用夹子固定，置于暗盒中曝光。而含有凝胶的滤纸则可置于X光曝光盒中放射自显影。一般³²P曝光过夜即可，而³⁵S为2～3天。

5、曝光完毕后的X光片即可冲洗，获得序列信息。将X光片置于水中先湿润，然后置于显影液中显影，直至条带清晰显示为止。X光片用水淋洗片刻后置于定影液中定影15分钟以上。取出X光片干燥并读出序列。

【注意】

1、去除尿素是非常重要的，如果有残存的尿素，则在干胶过程中会使凝胶很粘，而无法进行放射自显影。可以用10%冰醋酸洗二次，第一次15分钟，第二次10分钟。如果胶浓度高于12%，则有可能在干胶过程中会产生皱纹，防止的方法有二种：（1）冰醋酸溶液中加入1%～2%的甘油；（2）不干燥胶，直接在冰箱中以冰冻状态曝光，应注意的是在使用这个方法时，要在凝胶和X光片之间加一层薄的塑料薄膜。一般来说都使用第一种方法。

2、凝胶一定要充分干燥方可进行曝光，否则X光片会粘在胶的表面，致使以后的操作困难。

3、曝光时间应根据所使用的同位素而定，如果同位素已过半衰期则应相应延长曝光的时间。