|
杂交 互补杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。如用于基因表达检测，杂交时需要高盐浓度、样品浓度高、低温和长时间（往往要求过夜），但严谨性要求则比较低，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度；若用于突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要故需要在短时间内（几小时）、低盐、高温条件下高严谨性杂交。多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位都必须检测出来，通常设计出一套四种寡聚核酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。 杂交反应还必须考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。有资料显示探针和芯片之间适当长度的连接臂可使杂交效率提高150倍。连接臂上任何正或负电荷都将减少杂交效率。由于探针和检测基因均带负电荷，因此影响他们之间的杂交结合，为此德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等提出用不带电荷的肽核酸（PNA）做探针效果更好。虽然PNA的制备比较复杂，但与DNA探针比较有许多特点，如不需要盐离子，因此可防止检测基因二级结构的形成及自身复性。由于PNA-DNA结合更加稳定和特异，因此更有利于单碱基错配基因的检测。我们在这里简单介绍一些常用杂交试剂和消耗品。 对于商品化的芯片和Array类产品，通常都有配套的杂交试剂以方便使用。例如： 1. Clontech公司的Altas Glass Microarrays，产品已经包含GlassHyb™ Hybridization Solution和GlassHyb™ Wash Solution，能有效缩短杂交时间，提高信噪比。同时还提供了方便使用的Altas Glass Hybridization Chamber，旋盖式的设计和1.8ml的容积，避免了传统coverslip式杂交盒的弊端。可以单独购买。 7899-1 Altas Glass Hybridization Chamber each 2. Clontech ExpressHyb Hybridization Solution快速杂交液能有效加快杂交速度，减少杂交时间，同时提高灵敏度。适用于各种基于膜的核酸杂交反应，如cDNA Array、Southern、Northern、菌落原位杂交，特别是Clontech公司的Altas系列、MTN系列、MTE系列的各种膜基质的Macroarray。在这些系列的产品中均配有快速杂交液样品。由于膜可以反复使用，通常需要另外购买快速杂交液。 8015-1 ExpressHyb Hybridization Solution 250ml 3. 对于自己制作的芯片，可以自行配置杂交缓冲液，也可以参考Ambion公司提供的几种Glass Array 杂交缓冲液。SlideHyb™ Glass Array Hybridization Survey Kit是专为玻片或者尼龙膜基质的玻片DNA Array优化杂交条件而设计的。由于芯片的杂交条件受多种因素的影响，Ambion认为很难找到一种适用于所有芯片的杂交缓冲液。在这个试剂盒中提供了4种严谨程度不同的杂交液，供不同的需要。1号缓冲液的杂交条件是最严谨的，背景最低，2、3号的灵敏度相应提高而背景也相应升高，4号缓冲液没有去垢剂。这些杂交液可以单独购买，连预先配好的SDS、SSC等常用缓冲液都可以在Ambion买到。毕竟在芯片这样精密的实验中，在这么小的一个点上的DNA的量是非常有限的，要得到理想的结果需要非常精确的反应条件。Ambion 同样提供芯片杂交盒，抗化学腐蚀，耐70度高温，一次可放三张片。 Cat. No. Product Name Size 1860 SlideHyb™GlassArray Hybridization Survey Kit 100rxns |
|
4. Ambion同样提供适用于各种核酸膜杂交的杂交液和Wash Buffer，精心优化的反应条件有效提高杂交灵敏度和降低背景，已经经过ULTRArray™ （Ambion）， Atlas™（Clontech），LifeGrid™ （Incyte Genomics），GeneFilter® （Research Genetics），and Panorama™（Sigma-Genosys）arrays等产品验证。 Cat# ProductName Size 7118 Yeast RNA 10 x 10 mg/ml 图像的采集和分析 当生物芯片和样品探针杂交完毕后，就需要对杂交结果进行图象采集和分析。一般膜芯片的杂交都用同位素p32、p33作标记，其信号的检测需通过传统的磷光成像系统来完成。而对于用荧光标记的玻璃芯片杂交后的检测，则需要用专门的荧光芯片扫描仪。 1. 磷感屏成像系统Cyclone Storage Phosphor System Cyclone磷屏成像系统为美国Packard公司生产的第一台集高分辨率、高灵敏度和5个数量级的线性范围于一身的计算机控制数字化自动放射成像分析系统，由于其使用方便、快捷、自动化程度、分辨率、图像清晰度均很高，既可定位亦可定量，目前已广泛应用于核医药学、细胞与分子生物学、生物化学、药理学、基因工程学、药物代谢动力学、放射免疫及受体免疫等多方面实验研究，成为十分方便的有力工具。其优异品质主要得益于Packard专利的激光技术和共聚焦成像系统。应用范围为我们前面介绍的DNA Macroarray以及Northern、Southern、Western Blot.，手工测序，放射性原位杂交等的同位素结果检测。使用Cyclon磷屏可以大大缩短研究周期，获得清晰的分辨率。 其工作原理在于：同位素标记的杂交结果在磷屏上曝光，曝光过程32P等核素核衰变同时发射β射线，首先激发磷屏上分子，使磷屏吸收能量分子发生氧化反应，以高能氧化态形式储存在磷屏分子中。激光扫描磷屏，对于激发态高能氧化态磷屏分子发生还原反应，即从激发态回到基态时多余的能量以光子形式释放，从而在PMT捕获进行光电转换，磷屏分子回到还原态。计算机接受电信号，经处理形成屏幕图像，并进一步分析和定量。一般化学发光物质如荧光染料标记样品成像过程与放射性类似。 系统特点 放射性自显影成像系统。储存式磷屏根据不同样品厚度、射线能量有多种型号磷屏可供选择，磷屏可以多次重复使用。 |
|
2. 荧光芯片扫描仪 由于杂交时产生序列重叠，会有成百上千的杂交点出现在图谱上，形成极为复杂的杂交图谱。序列重叠虽然可为每个碱基的正确读出提供足够的信息，可提高序列分析的可靠性，但同时信息处理量也大大增加了。一般说来，这些图谱的多态性处理与存储都由专门设计的软件来完成，而不是通过对比进行人工读谱。用计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。扫描一张10cm2的芯片大概需要2～6分钟的时间。目前专用于荧光扫描的扫描仪根据原理不同大致分为两类：一是激光共聚焦显微镜的原理，是基于PMT（photomultiplier tube，光电倍增管）的检测系统（另文介绍）；另一种是CCD（charge-coupled devices，电荷偶合装置）摄像原理检测光子。CCD一次可成像很大面积的区域，而以PMT为基础的荧光扫描仪则是以单束固定波长的激光来扫描，因此或者需要激光头，或者需要目的芯片的机械运动来使激光扫到整个面积，这样就需要耗费较多的时间来扫描；但是CCD有其缺点：目前性能最优越的CCD数字相机的成像面积只有16×12mm（像素为10μm），因此要达到整个芯片的面积20×60mm的话，需要数个数码相机同时工作，或者也可以以降低分辨率为代价来获得扫描精度不是很高的图像。由于灵敏度和分辩率较低，比较适合临床诊断用。 生产商业化扫描仪的公司包括：Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic Microsystems公司、Axon Instruments公司等。其中GSI Lumonics 公司ScanArray系列一直是生物芯片扫描检测系统中的领头产品。2000GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的软、硬件都得到进一步加强。 ScanArray利用其专利的激光共聚焦光学系统，通过计算机控制，对生物芯片的荧光杂交信号进行全自动的扫描采集，并通过分析软件对数据结果进行定量分析。 最高灵敏度高：<0.1荧光分子/μm 不同波长依次扫描避免交叉光污染。 扫描后的图像还需要进一步的处理，这要求一定的软件支持。现有的分析软件包括：Biodiscovery的ImaGene系列，Axon Instruments的GenePix系列，GSI的QuantArray等。 3. 基因芯片上各克隆荧光信号的分析原理 用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1/35～1/5），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1/35～1/5），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得到到有关基因图谱。美国GSI Lumonics 公司开发出专专业基因芯片检测系统（ScanArray 系列），采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号采集，由计算机处理荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。利用QuantArray软件包对扫描的荧光信号进行分析，比较每个克隆在不同组织间表达水平的差别。软件具体分析步骤如下： 首先，同时导入同一区域两个channel扫描的图像文件；将两个channel扫描的图像用不同的颜色显示并重叠；选择拟分析的区域，输入矩阵的行数及列数以及矩阵的个数等参数；在计算机给出的该区域信号图片上标定网格，使得网格中所包含的横线和竖线的交点个数同每个区域点样的克隆数相同，调整网格，使每个交点均位于点样克隆信号的中心；信号的中心确定后，计算机将自动以交点为中心，按照设定的半径圈定各克隆，并将其内部区域作为待分析的信号，同时在圈定的各克隆周围再按照预设的值圈定一定范围的区域，将该区域内的信号作为背景噪音；计算机分析每个克隆扣除背景噪音后的信号强度，并按照不同的要求对数据进行分析；利用GenePie方式对两个channel信号的进行定量比较分析，此时计算机根据各克隆两个channel扫描的信号，以饼图的形式给出两个channel信号强度的相对比例，同时可以逐个克隆读取计算机分析出的两个channel信号的值及所占的比例，进而确定各克隆在两种组织间的表达差异。 |
|
4. Microarray数据分析 Microarray数据分析简单来说就是对Microarray高密度杂交点阵图象处理并从中提取杂交点的荧光强度信号进行定量分析，通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类，最终整合杂交点的生物学信息，发现基因的表达谱与功能可能存在的联系。 Microarray数据分析主要包括图象分析（Biodiscovery Imagene 4.0\Quantarray分析软件）、标准化处理（normalization）、Ratio值分析、基因聚类分析（Gene Clustering）。 1. 图象分析：激光扫描仪Scaner得到的Cy3/Cy5图象文件通过划格（Griding），确定杂交点范围，过滤背景噪音，提取得到基因表达的荧光信号强度值，最后以列表形式输出。 2. 标准化处理（Normalization）：由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡，需对cy3和cy5的原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据，Normalization正是基于此种目的。Normalization的方法有多种：一组内参照基因（如一组看家基因）校正Microarray所有的基因、阳性基因、阴性基因、单个基因。 3. Ratio分析（Ratio Analysis）：cy3/cy5的比值，又称R/G值。一般0.5～2.0范围内的基因不存在显著表达差异，该范围之外则认为基因的表达出现显著改变。由于实验条件的不同，此域值范围会根据可信区间有所调整。处理后得到的信息再根据不同要求以各种形式输出，如柱形图、饼形图、点图、原始图像拼图等。将每个Spot的所有相关信息如位标、基因名称、克隆号、PCR结果、信号强度、Ratio值等自动关联并根据需要筛选数据。每个Spot的原始图像另存文件，可根据需要任意排序，得到原始图像的拼图，对于结果分析十分有利。 4. 聚类分析（Clustering Analysis）：实际是一种数据统计分析。通过建立各种不同的数学模型，可以得到各种统计分析结果，确定不同基因在表达上的相关性，从而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能。Gene Clustering就是根据统计分析原理，对具有相同统计行为的多个基因进行归类的分析方法，归为一个簇的基因在功能上可能相似或关联。目前以直观图形显示GeneCluster结果的程序已有人开发出来，可将抽象的数据结果转化成直观的树形图，便于研究人员理解和分析。 尽管基因芯片技术受到了广泛关注，但在基因表达谱分析中起着关键作用的生物信息学却没能引起大家的足够重视，认为简单人工处理一下原始数据就可以得到有价值的生物学信息，大量有价值的信息就这样被浪费和湮没了。可以肯定地说，没有生物信息学的有效参与，基因芯片技术就不能发挥最大效能。加大基因芯片技术中生物信息学的研究开发力度已成为当务之急。国内外已经进行了有益的尝试，初步开发出供芯片平台管理实验数据的软件包，就目前实际情况来看，生物信息学在基因芯片研究开发中介入的程度已经越来越深，主要涉及基因表达信息分析管理系统及其分析工具和分析方法，简单概括为以下几个方面： 基因表达数据库 基因表达数据库是整个基因表达信息分析管理系统的核心。Microarray数据库起着数据储存和查询、各种相关信息的整合的作用。Microarray数据库可以包含用户的管理信息、原始实验结果（图像文件、信号强度值、背景平均值行列号、基因号等）、各种实验参数（Plates/unigene/Sets/Clusters）、探针相关信息、 clone相关信息（基因名称、基因序列、GenBank accession号、克隆标志符（IMAGE和内部）、代谢途径标志符、内部克隆标志符）、分析处理结果、芯片设计相关的资源和数据，等等。 分析方法： 选择分析方法的基本标准：能够简化原始数据，结果直观，使研究者能在海量基因表达数据中解析出正确的基因表达谱和功能信息。一个理想的分析方法是建立在合理的算法基础之上的，应该能全面综合并直观地解析原始数据，修正已有数据，并从结构、序列、功能之间找到新联系。目前已有报道用于microarray数据分析的方法主要有以下几种： |
|
手工分类法（Manual classification Method） 该方法在Botstein 实验室的Michael Eisen提出新的分析方法之前是唯一用来分析microarray数据的方法。其基本原理是通过对microarray的ratio值从大到小排序，筛出表达显著性改变的基因。结果可直观地从二维plot图得到。优点是能够有效筛选潜在的肿瘤标记基因和药物靶位点；可以构建多组基因诱导或抑制的时间表达谱。缺点是结论过于简单；很难发现更高层次功能线索；处理耗时且不能充分利用数据，也不能发现实验错误。 非监督聚类法（Unsupervised Clustering） 又称配对平均连锁聚类分析（Pairwise average-linkage cluster analysis）。该方法是分层聚类的一种形式，非常类似系统发生分析。该方法是基于标准相关系数的计算。K -mean方法是unsupervised聚类法的一个变化，目前Stanford University 的Botstein实验室和NHGRI的Trent实验室都采用该分析方法。 混合聚类法（Hybrid clustering approach） 该聚类方法通过将每一数据点傅立叶变换寻找那些表达呈周期性变化的基因，比如细胞周期涉及的基因。所谓混合聚类就是先unsupervised聚类再supervised聚类。优点是可以整合以前手工聚类法得到的数据；尤其适合确认细胞周期调控的特征性表达谱。 神经网络方法（Neural network approach） 运用自组织图（Self organizing maps）并结合supervised法进行聚类。优点是分类标准明确；优化的次序好于其它聚类法；用一种次序风格处理大量数据易于被生物学家接受。 生物芯片（DNA微阵列）荧光扫描仪中的激光共聚焦扫描技术 所有的微阵列上的荧光须经荧光扫描装置来分析其上的荧光强度和分布，在这些装置中，激光共聚焦扫描仪具有优越的性能，能获取高质量的图像和数据，本文将分别介绍微阵列的相关特性和各种类型的微阵列扫描仪，激光共聚焦扫描仪的设计和关键特性，另外还将介绍一种已商品化的激光共聚焦荧光扫描装置。 微阵列是由分子整齐排列于固相表面，这些分子与荧光分子结合，测定荧光分子的强度后可推知结合分子的浓度。固相部分主要有经过表面化学处理的玻璃片如22mm×75mm的载玻片。在微阵列上包被的分子常常能与多种荧光探针通过化学键相互作用而联结，通常情况下能联结两种荧光分子，例如在检测不同样品的基因表达的区别时，可将其中一样品（如正常组织）标记上发绿光的荧光分子，将另一种样品如肿瘤组织或发病组织标记上另一种发红光的荧光分子，用两种波长的激光激发微阵列上的样品，通过比较两种荧光在微阵列上某点的比例得知某类基因在两种组织中的差异。 微阵列上有样品组成的点阵，除了点之外，余下的是背景。如果玻璃片未经过表面化学处理，样品在玻片上结合不牢固，且容易扩散，造成背景高。若玻璃片经过表面化学处理后，点样的样品在微阵列上结合牢固，点的直径小，不扩散，从而点的密度增加，在进行荧光数据分析时，仪器将点上的荧光强度与点周围的背景强度相比较，如果背景中含有与荧光波段相一致的物质，则背景强度增高，样品的荧光信号将减弱，干扰信号的读取。 点阵上的点直径范围为25mm～500mm，通常目前能达到的直径为100mm±50，科学家们正在努力减小直径。因为点直径的变化对扫描结果的读取产生影响，如果点的直径大，荧光分子扩散的范围也大，则观察到的荧光强度相对较弱。 |
|
若在玻片上有灰尘或其它杂质如衣物纤维、皮屑、指纹等，扫描结果将受到影响。微阵列上的点干燥后形成很薄的层，使得激光共聚焦扫描成为可能，精心地调整扫描仪的焦距，可避免检测出不需要的背景杂质，包括微阵列上的灰尘、玻璃中自带的荧光杂质产生的干扰信号均可通过激光共聚焦的方式将其减少到最低程度。因为杂交因素影响，在微阵列上点与点之间的荧光强度差别很大。对微阵列扫描仪的要求要能够有较宽范围的灵敏度，通常来说，灵敏度调整范围为10000：1。 当荧光化合物或染料受到激光激发后将释放出荧光，在某一波长下有一最高释放强度。各种荧光化合物有各自特定的激发吸收值。如图1是FITC的波长对荧光激发强度曲线。从曲线图可见，在494纳米波长下，有一激发高峰，在518纳米下有一释放高峰，释放与激发高峰波长相差24纳米，这一现象在微阵列使用的染料中较普遍。两高峰波长的差值在专业上称之为Strokes shift，初看曲线图人们可能会以为：FITC在510纳米的波长激发下，在475～510纳米范围内将释放部分荧光，其实并不尽然；释放波长一般情况下大于激发波长，在图中的激发曲线不是与释放曲线同时绘制的，将它们放在同一坐标图中是为了便于观看，其实它们是两套不同的数据。激发曲线的绘制过程如下：在单一长波长下，变换激发波长在不同波长下测定荧光释放强度，释放荧光曲线的绘制过程则是在最长激发波长下开始增加波长，测定在不同波长下的荧光释放强度。微阵列扫描仪设计者通过阅读和分析某中荧光染料的激发曲线和释放曲线来确定适合某种染料的复合扫描激发波长，该波长的激发效率至少要达到50～70%的水平。激发波长要避免太接近释放高峰对应的波长，否则荧光信号受到干扰。所以应在峰值的左边选择一激发波长。如对FITC来说，建议的激发波长在470～495nm.荧光释放强度在某一范围内，与激发光的强度成正比，当荧光释放达到最高峰后，增加激发光强度却不能提高释放强度，因为荧光释放已经达到饱和或光子将染料破坏淬灭。微阵列上各点的荧光分子受到激发后，从各个方向释放荧光光子，散射成球状，所以扫描仪须将这些散射的光子采集到，由于扫描仪的使用的是很低的释放光，几何球状是设计扫描设备的主要根据。
图1 FITC的波长对荧光激发强度曲线 微阵列扫描仪可有多种设计类型，但任何类型的微阵列扫描仪都有以下基本功能： 激发光 激发光的产生源有多种，如激光、氩灯、LEDs或钨丝灯。激发光的波长要避免将释放光的波长覆盖或重叠。对于LEDs或钨丝灯需用滤光器来选择某种特定波长的光。激光的波长单一不需要滤光器来选择某种特定波长的光。灯泡光源可产生多个波长的激发光，通过多个滤光器可选择多种特定的波长以满足激发不同荧光的需要。激发光应直接射向微阵列上的待测样品，通过大量一次照明的方式，待测样品的大部分区域同时受到激发，这种方式在CCD数码相机中较常见，该方式的缺陷是待测样品的受到得激发光不够均匀一致。这点是仪器设计者须考虑到的重要因数之一。另一种方式是：激发光聚焦于样品的很小部分，采用特定的光线采集和定位，聚焦点上的激发光光线密度较高，大约为10000watt/cm2。激发波长的选择是依据染料的激发曲线和释放曲线的峰值来确定的，在染料激发峰值的左边且激发效率较高的范围内，在某种染料水平下，激发效率越低，要达到某种光强，则需要向样品上发射的光越多。过多的发射光将通过光漂白作用破坏样品和污染干扰释放光的信号。 |
|
释放光采集 荧光由目镜的镜头来采集，该镜头聚焦于样品上并将一定区域内的光线收集到装置。收集的角度区域的大小非常关键，荧光释放是球形的，目镜对荧光的采集范围是决定仪器的采集效率关键指标之一。目镜采集光的角度由数值孔径来表示，图2表示了数值孔径与光采集效率之间的变化关系。当数值孔径为1.0时，目镜将收集到整个半球的光，相应的光采集效率为50%。在许多激光共聚焦微阵列扫描仪的数值孔径在 0.5～0.9，而CCD-扫描仪的数值孔径为0.2～0.5。有其他类型的扫描仪不用目镜而是使用积分球面镜来采集释放的部分光源，但是部分光线经过多次球面反射而衰减。还有一些无散光收集装置，仅仅是将探测器放在样品的某一区域的上方，光线采集的效率受限于样品被照明处的范围及探测器的视角，例如，一个直径为25mm的探测器放在激发点上方100mm处，其实际的有效数值孔径为0.12。图2显示目镜的不同数值孔径与光采集效率的关系。
图2 目镜的不同数值孔径与光采集效率的关系 空间定位 是指对样品上的某一小区域上的荧光信号进行荧光强度计算，微阵列上的各点样品被分割为许多微小的像素，在进行荧光信号定量时，空间分辨率必须高于个点的大小，如微阵列上各点的直径为100mm，则像素的大小为5～20mm。空间定位可通过多元素探测器，如CCD或机械扫描装置。许多相机设置为大范围照明，探测器直接提供由许多像素组成的图像，该方法的缺陷是CCD提供的目镜数值口径较小，后方照明及维持系统冷却设备价值昂贵，由于光散射会导致像素之间交叉重叠造成信号不够清晰。机械扫描过程包括以下几个步骤：将激发光束聚焦于某一大小同像素差不多的点上，用单一元素的探测器采集那一小点上的释放光。要将整个样品扫描完全，则需移动样品或用一微小的反光镜使激光束移动扫描样品。虽然扫描装置增加了机械装置的复杂程度，但比起CCD相机来，机械扫描可达到的数值孔径更高，有更好的空间选择性，探测器也较便宜些。在低强度的光源下，高光线采集率是至关重要的。 激发/释放分辨 微阵列上各点的荧光释放强度通常要比激发光强度弱几个数量级，要从激发光中检测出微弱的荧光信号，就需要对这两种类型的光进行分离，由于光束中的光波长不相同，可利用光波分离将不同的光分开。许多装有目镜的扫描仪采用的是表面照明方式，激发光束与释放光束从样品到目镜经过同样的路径只是方向相反。这种途径使得从样品上反射和散射的光与荧光束混合在一起，所以需要用光束分离器对混合光进行分离。一种类型的光束过滤器是色彩二向或多向过滤器。它将激发光束反射并把释放光束以一较长的波长传输。这种滤光器对一、二或三种不同的激发/释放光都可进行较好的分离，但若超过四种以上的混合光束则分离有困难。另外一种类型的光线分离器称为几何光线分离器，如图3所示，在扫描系统中，目镜的数值孔径为0.6，像素的大小为10mm，从目镜出来的激发光束比释放光束细，一个小反光镜将激光束反射但是让环形部分的释放光束通过，其分离效果与波长光束分离器相同。从理论上来说，光束分离器可以完全将激发和释放光束分开，但实际上并非如此，通常在探测器前放滤光片过滤释放光束。这些滤光片只允许染料的释放高峰附近很窄的一段波长的光通过，而其他波长的光包括激发光都被阻挡了。这是微阵列扫描仪必需的的第二道光束分离装置。有的扫描仪不用光束分离器而是将激发光束和释放光束放在不同的轴上。该方法能将释放光路径的激发光发射回去，但却难以达到较高的数值孔径，因为目镜离样品很近，通常小于1毫米，所以激发光束能进入目镜的角度范围很小。其他具有区分不同波长光束的装置有棱镜、光栅等，这些装置还可产生一些特殊的作用如连续的光波调谐功能。然而，在微阵列中，由于要求对激发光有高度的敏感性，因而对释放光装置也相应要求有很高的精密度。 |
|
图3 在上位照明扫描仪中的光束分离器 检测荧光扫描仪的探测器 将微弱的荧光信号转化为电信号,在微阵列扫描仪中的光线探测器有：光电倍增管、CCD点阵探测器、雪崩光电二极管。各种装置有其优点也有其缺点。不同检测范围的仪器要根据它们各自的特点来选择合适的探测装置。光电倍增管在可见光波范围内是最灵敏的探测器，它属于单点探测器并要求扫描系统对微阵列上的样品进行空间定位，通过改变电压可以很方便地改变光电倍增管的灵敏度。光电倍增管的灵敏度在红外及近红外波长范围内降低得很快，所以它们的用途主要限制在可见光波长范围内。CCD对微弱信号的放大功能不及光电倍增管，因而需要额外的放大系统来将信号放大才能达到光电倍增管的灵敏度范围的上限。其主要的缺点是：CCD探测器的实际数值孔径难以达到06-09的范围，在低亮度背景下，限制微弱信号被检测出来，另外CCD探测器不能与共聚焦系统相兼容；但是在高亮度背景下，因为CCD探测器有内置式扫描功能，其优越性就体现出来了。 所有的微阵列扫描仪都有固定和放置微阵列固相基质的装置，我们称之为扫描仪的载样盒。载样盒要有能够容纳下玻片的空间，组成其的材料应能经受的住上千次取放样品的刮擦考验。通常微阵列的固体介质为显微载玻片，还有塑料片，但是塑料片不如玻璃片刚硬，容易变形，不易聚焦准确，所以多数研究者使用的是显微载玻片。扫描检测时通常是在室温下进行，此时玻片上各点样品已经干燥，然而，有些染料如FITC在潮湿的环境下才能释放出强烈的荧光，所以研究者们在待测样品上滴加适量的缓冲液，然后盖上盖玻片进行观察。这就需要载样盒能够容纳载玻片与盖玻片叠加之后的厚度，扫描仪在扫描时聚焦于盖玻片下的那一层平面进行扫描。 以下要介绍共聚焦扫描微阵列的工作原理，顾名思义，共聚焦扫描仪将视野中的两个聚焦点的影象装配为二维图像，工作过程如所示：平行的激光束通过光束分离器后进入目镜，目镜采集到部分球状散射的荧光释放光并使这些光成为平行的光束，此外还采集被反射的激光，这些激光的强度要比荧光强度大3～7倍。采集回来的光束再次通过光束分离器，光束分离器将大部分激光反射回激光源处，并允许大部分荧光束通过光束分离器，一面平面镜将荧光束反射到释放光栅处，光栅选择很窄范围波长的光通过，并将剩余的激光激发光全部反射回去。共聚焦的工作特点体现在探测目镜和开了一个针孔大的孔的光线挡板上，探测目镜将平行光聚集为很小直径的一束光之后，挡板上的小孔只允许聚焦的光线通过并将其余的光遮挡住。图5显示若发光点不在目镜焦点范围内，则光线将被探测目镜聚集于挡光板前，散射之后大部分光线被遮挡了，只有焦点范围内的光线才能有效地进入当光板的小孔被探测器检测到。对焦距范围的严格限制使得灰尘或近表面的小颗粒均不能成像被探测到，因而共聚焦扫描仪获得图象的信噪比要高于非共聚焦扫描装置。但另一方面，对焦距范围的严格限制要求载玻片摆放非常平稳，扫描运动过程中载样盒要保持在同一水平面上，偏差要小于焦距的范围，偏差小于±10mm。这一要求增加了机械加工的精密度，使得加工工艺更加复杂，但这是保证获得最佳图象质量的有效途径之一。 |
|
图4共聚焦扫描的工作原理
图5目镜焦点范围之外的光线被遮挡 由于激光共聚焦于载玻片上的一点上，要获得整张玻片上的各点的荧光信息则要对玻片各点进行扫描成像。可通过移动扫描器或移动目镜和载玻片来实现上述功能。扫描器移动后要求目镜能采集到荧光释放光束，这样的目镜很复杂且数值孔径不超过0.3，较为简单的并且采集光效率高的办法是移动目镜或载玻片，但移动的物体大势必影响扫描速度。不过在弱光环境下，图像读取速度取决于探测到的光子的累积量，所以即使扫描速度快而光采集效率低的话图象读取信号也未必快。 所有的扫描仪都会面临同样的一个问题，即如何将背景降低并提高待测样品的信号。共聚焦技术的应用使得共聚焦扫描仪能比其它类型的扫描仪获得更高质量的图像信号。在共聚焦扫描仪中有光束分离器及释放光栅将荧光信号分离并传输给探测器，而将激发光和杂质产生的光反射回去并阻挡它们到达探测器。探测器是光电倍增管，其灵敏度高，可探测到一个光子的存在，光电倍增管内的功率放大器可将光信号转化为电信号并放大100万倍，通过调整电压输出可改变光电倍增管的灵敏度范围，微阵列上不同样品的制备过程导致对仪器灵敏度要求不同，内置式的可调灵敏度装置恰好可适应这些不同的变换。传统的硅探测器如PIN光电二极管，没有内置放大装置，在可见光范围内灵敏度很低，因而需要外置的功率放大器，这就增加了杂讯，降低了信噪比。硅探测器在800～900nm范围内有一波长应答高峰，因此用它们探测近红外范围的染料较为理想。光电倍增管通常在500nm左右范围内有一波长应答高峰，高于650nm后则灵敏度迅速降低。它们适用于大部分可见光范围的染料。 微阵列扫描仪灵敏度范围要求：在微阵列样品制备过程中，步骤较多，如PCR反应、杂交反应条件变化多、试剂存储条件不同、不同类型的基因表达等因素的影响，即使适用相同的染料，其亮度也可能相差1000倍，在同一快微阵列上的荧光强度范围可达到4000：1的范围。大部分扫描仪的荧光强度读取范围在4000～16000，若不改变仪器的灵敏度范围，就无法适应各种荧光强度样品的读取。调整仪器灵敏度范围的方法有两种：其一是改变激发光的强度，用激光衰减器可调整改变激发光的强度其可调范围至少为100：1。其二是改变光电倍增管的灵敏度，通过变化输入电压的大小，光电倍增管的灵敏度改变范围至少为100：1。两项调整方式可相互叠加使得仪器的调整范围增加到10000：1，这一范围对普通的扫描仪都足够了。通常人们希望使用的激光强度大而不破坏样品上的荧光分子，我们已经知道，激光强度越大激发的荧光光子越多，信号也越清楚和强烈。但是若样品经过多次扫描后，被破坏的荧光光子将增加，所以要将荧光强度降低以防样品上的荧光淬灭。 |
|
信号转换及采样过程：由被激发的荧光染料产生的光学信号将通过一系列过程转变为数码信号。荧光信号是由一系列随机的光子释放累加而成。若将它们累计可与某一样品区域的染料分子的密度相关。通常扫描仪对空间上和时间上探测到的荧光光子的数量都加以累计并取平均值才能代表某一样品区域的染料分子的密度。被扫描的区域被分为大小相同的像素。激光共聚焦和其它点-照明式扫描仪对逐个像素进行激发，然后探测器累加各像素点上荧光释放分子。将光信号转化为电信号并数值化。各像素的数码分辨率可达到16-比特，当扫描图像正在进行时，显示器要显示图像以供扫描者作初步的分析，扫描过程结束后可将图像保存为图像格式文件如TIFF格式，这种格式的图像文件时目前用途较广的一种图像文件。 控制和自动化系统是由电脑来完成的。扫描仪使用者无须精通扫描仪的光学和电子学部分，已商品化的扫描仪已经经过大量的测试和信息反馈并不断地改进，使其用户界面越来越友好，图形化的操作界面使得初学者只需接受简单的训练或阅读操作手册就能够使用仪器。控制软件具有许多自动设置功能，为使用者节省时间提高工作效率。如：不同的用户扫描不同样品可设置、保存、再现扫描参数；可自动设定2个以上的扫描激光波长并自动保存图像结果；对某一扫描波段自动调整灵敏度、激发光强度、及探测器探测范围等。 扫描仪各部件功能参数主要如下： 激光源的数目和荧光波段 第一代微阵列扫描仪通常是两个或四个荧光波段及两个激光光源，而第二代仪器则含三或四个激光光源并可选择10种荧光波段。 另外，分辨率、灵敏度、扫描速度、扫描视野、扫描图像定位的准确程度等指标也是设计和制造微阵列扫描仪所需考虑的技术指标。微阵列扫描仪之间的比较是一个复杂的过程，不应仅仅对单个性能参数进行比较，通常需要对扫描样品进行综合测试。 ScanArray共聚焦微阵列扫描仪 General Scanning ,Inc.公司已经建立了ScanArray共聚焦微阵列扫描仪的生产线，目前全世界的许多生物技术和遗传基因组分析实验室都在使用该种仪器进行科研工作。 ScanArray的结构组成是：样品载体移动、光源固定、多个激光头的共聚焦扫描仪。数值孔径可达0.75，扫描速度达20线/秒。 ScanArray共聚焦微阵列扫描仪优越性能表现在：操作简单、体积小，数值孔径高、扫描速度快，灵敏度和分辨率高。 目前有两种型号：ScanArrayâ3000和ScanArrayâ5000，它们的性能如下：
|
→如果您认为本词条还有待完善，请 编辑词条
上一篇离心机的使用技术 下一篇液压式万能试验机操作规程
词条内容仅供参考，如果您需要解决具体问题
（尤其在法律、医学等领域），建议您咨询相关领域专业人士。
1
收藏到: 
