(一)原理: 叶绿素是一种极不稳定的化合物。它是一种二羧酸-叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯,故可与碱起皂化反应而生成醇(甲醇和叶绿醇)和叶绿酸的盐,产生的盐能溶于水中,可用此法将叶绿素与胡萝卜素分开。叶绿素与胡萝卜素都具有光学活性,表现出一定的吸收光谱,可用分光镜检查或用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态,激发态的叶绿素分子很不稳定,当它变回到基态时可发射出红光量子,因而产生荧光。叶绿素中的镁可以被H离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素,铜代叶绿素很稳定,在光下不易破坏,故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。叶绿素的化学性质很不稳定,容易受强光的破坏,特别是当叶绿素与蛋白质分离以后,破坏更快,而胡萝卜素则较稳定。在有氧存在下,叶绿素在甲醇中放置一、二天就转变成加温或室温长期放置会转变成叶绿素a‘和叶绿素b’。因此,在试验中要注意控制这些因素。皂化反应式如下:C32H30NMg (二)材料、仪器设备和试剂 1. 材料:菠菜叶片 2. 仪器设备:刻度试管,小试管,试管架,石棉网,烧杯,酒精灯,玻棒,铁三角架,刻度吸量管,火柴 3. 试剂:95%乙醇,苯,醋酸铜粉末,5%稀盐酸,醋酸-醋酸铜溶液:用50%醋酸100ml 溶入醋酸铜6g,再加蒸馏水4倍稀释而成;KOH-甲醇溶液:20gKOH溶入100ml 甲醇中,过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。 (三)实验步骤 本实验第一项中提取的叶绿体色素乙醇溶液进行以下实验: 1. 光对叶绿素的破坏作用 (1) 取1支小试管,各加入2.5ml 叶绿体色素乙醇提取液,并用95%乙醇稀释1倍。其中1支放在直射光下,另外1支放到暗处,40min后对比观察颜色有何变化,解释其原因。 (2) 另取本实验中用圆形滤纸层析分离成的色谱一张,通过中线裁成两半,一半放在直射光下,另一半放在暗中,半小时后比较两张色谱上的四种色素的颜色各有何变化。 2. 荧光现象的观察 取一支20ml 刻度试管加入5ml 浓的叶绿体色素乙醇提取液,在直射光下观察溶液的透射光反射光颜色有何不同,解释原因。 3. 皂化作用(绿色素和黄色素的分离) (1) 在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液,充分摇匀。 (2) 片刻后,加入5ml 苯,摇匀,再沿试管壁慢慢加入1-1.5ml蒸馏水,轻轻混匀(勿激烈摇荡), 于试管架上静置分层。若溶液不分层,则用滴管吸取蒸馏水,沿试管滴加,边滴加边摇动,直到溶液开 始分层时,静置。可以看到溶液逐渐分为两层,下层是稀的乙醇溶液,其中溶有皂化的叶绿素a和b(还有少量的叶黄素),上层是苯溶液,其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。 4. H+和Cu+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用 (1) 取两支试管,第一支试管加叶绿体色素提取液2ml,作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液5ml,再加入5%HCl数滴,摇匀,观察溶液颜色变化。 (2) 当溶液变褐后,再加入少量醋酸铜粉末,微微加热,观察记载溶液颜色变化情况,并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。 (3) 另取醋酸-醋酸铜溶液20ml,置于烧杯中。取新鲜植物叶两片,放入烧杯中,用酒精慢慢加热, 随时观察并记录叶片颜色的变化,直至颜色不再变化为止。解释原因。 注意事项:在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液,易乳化而出现白色絮状物,溶液混浊,且不分。 |
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