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生物芯片作为超高通量筛选平台的应用

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在过去的十几年里,随着科学的进步以及在巨大的经济利益驱使下,药物筛选技术得到了飞速的发展。在80年代中期(高通量筛选形成之初),每天只能筛选30种化合物,到90年代中期,每天可筛选1,500种化合物,而如今每天可筛选超过 100,000个化合物。高速、低成本的高通量筛选已成为当今药物筛选的主流,并逐渐向超高通量方向发展。在过去的几年中,世界上著名的制药公司纷纷与以高通量药物筛选技术为核心的中小型生物科技公司结盟或合作,采用高通量或超高通量药物筛选技术进行先导物分子的筛选。要进一步提高筛选率,高通量筛选技术的各个方面均需要技术创新,这为生物芯片技术进入药物筛选领域提供了宝贵的契机。

提高药物筛选的通量,实现超高通量筛选有2 条途径:一是微型化,一是自动化。生物芯片作为一种新型技术平台,正可满足超高通量筛选微型化和自动化的需要。生物芯片技术应用于超高通量筛选有2个发展方向:一是微孔板/微阵列技术,一是微流体芯片技术。

微孔板/微陈列技术

微孔板技术的发展主要表现在板孔数的增加。目前,使用最多的是96孔及384孔板,也有人使用1536孔、3456孔、甚至 9600孔板。如Oldenburg等报道了用9600孔板(0.2μL/孔)分析系统,以金属蛋白酶为靶,对组合及分离纯化的化合物库进行筛选的结果。虽然随着材料科学和加工技术的发展,微孔板技术有了长足的进步,但其发展面临着一些不易解决的困难,主要有:微量液体极易蒸发,不适于那些不能用二甲亚砜(DMSO)作溶剂的筛选方法以及受限于当今还不够完善的微量液体分配技术。

微阵列技术是将微孔板技术进一步微型化。最近,哈佛大学的研究人员开发了化合物微阵列芯片,主要用于筛选能与特定蛋白质特异性结合的化合物。他们将玻片表面进行化学处理,使其衍生化产生活性基团,然后将溶于有机溶剂中的化合物用机械手点在经处理的玻片表面,化合物与玻片表面的活性基团反应而被固定于玻片表面,这样就将不同的化合物排布成微阵列,固定在玻片表面,制成化合物微阵列芯片。随后将感兴趣的蛋白质进行荧光标记,然后与微阵列芯片上的化合物反应,经清洗后,再进行荧光检测就可以筛到能与这种蛋白质特异性结合的化合物。他们用化合物微阵列芯片进行了原理性实验,其结果表明,使用这种化合物微阵列芯片可以并行、快速地进行大规模的化合物与蛋白质的结合筛选。他们最先是将玻璃片表面进行马来酰亚胺衍生化处理,后来采用亚硫酰氯处理,都获得了成功。他们还尝试了使用这种化合物微阵列芯片进行大规模对映异构体的分型检测。加利福尼亚大学Davis分校的科学家们采用类似的方法也制造了一种化合物微阵列芯片。他们对玻琥载玻片表面进行氨基化处理,在氨基玻片上进行乙醛酰衍生化,然后将带有连接臂的配体分子点在修饰过的玻片表面。在进行化学连接反应之后,这种固定了不同小分子配体的微阵列芯片被用来进行了3种生物学检测:蛋白质结合检测、功能磷酸化检测和活细胞粘附检测。实验结果证实了化合物微阵列芯片可以帮助我们对由组合合成方法获得的大量化合物进行快速的功能分析和筛选。化合物微阵列芯片技术与基于微珠体的固相组合会成技术相结合为高通量药物筛选带来了一条新的途径,将对高通量药物筛选技术的发展产生积极的影响。

最近,出现了一种被称为芯片膜片钳(patch-on- a-chip)的新技术。在这种膜片钳芯片上加工有检测电信号的点阵,点阵中的每一个点是一个电信号记录单元,同时每个点底部与负历相通,可以吸位细胞。这样膜片钳芯片上的每一个点就可以实现传统膜片钳技术的功能。膜片钳芯片具有操作简单、快速和可实现高通量等优点,可以用于电生理研究和高通量药物筛选。位于美国圣地亚哥的AVIVA公司正在致力于此项技术的开发。

微流体芯片技术

微流体装置的发展已广泛用于生化及细胞的分析。鉴于这项技术在超高通量筛选中的巨大应用前景,吸引了众多学术界和工业界的实验室对该项技术的研究与开发。借用半导体工业中所用的光刻技术将内径在10~100μm的做通道加工在玻璃或硅片中,利用电动泵和流体的压力来控制皮、纳升级液体的流动。该技术可减少几个数量级的试剂消耗量,并能提高数据质量。它所采用的并行样品处理程序可以获得更高的筛选通量。多种类型的筛选分析方法在微流体芯片上操作的可行性(包括结合分析、酶分析和细胞分析)已得到实验论证。

iang等制造了2种可以用于高通量检测食物污染物和进行药物筛选的微流体装置。他们以硅为模板,采用模压和毛细管成形技术在聚酯和多聚硅氧烷二甲酯中加工激流体网络。在第1种装置的微通道中夹着一块PVDF(polyvinylidene fluoride)膜可用来结合、浓缩目标化合物,然后直接通过质谱方法鉴定目标化合物。第2种装置被用来超滤分离本巴比妥和苯巴比妥与抗体的复合物。整个过程包括上样、清洗和解离都是连续进行的。这些微流体装置不仅可以显著降低系统死体积和所需样品量,而且与先前报道的方法相比灵敏度至少可提高 1~2个数量级。

Capliper Technologies公司设计的芯片装置,将从微孔板中取样与随后进行的酶抑制剂筛选结合在一起。目前,该芯片装置已制作完成,并通过了测试。测试的化合物通过与芯片相连的硅毛细管注射入芯片中,与酶及荧光酶底物混合以使它们在主反应通道内发生相互作用。酶与荧光底物反应产生基线荧光信号。如果测试化合物抑制酶的活性,信号将会暂时性的降低,通过检测荧光信号的强度就可以测定化合物抑制酶的活性。这种装置每次进样量 1~10nL,进样同期10~30s。利用这个系统,每块芯片可对几千种化合物进行筛选。目前对该系统进行改进的努力主要集中在提高系统的耐用性和将不同类型的筛选方法移植到这个平台上来。最新设计的微流体芯片将液体分发。化合物稀释与筛选分析 3者集成起来,由于减少了被视为瓶颈的芯片使用前的准备步骤,使得该系统更加方便实用。

目前,致力于开发微流体芯片技术并将其应用于药物筛选的公司有:

Caliper Technologies,Orchid BioSciences,ACLARA BioSciences,Li-Cor等。

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