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PCR假阴性的原因分析

标签: PCR 假阴性 原因 分析

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PCR的假阳性问题是在PCR诞生之初就被深刻认识到了,同时由于造成假阳性的因素相对单一,因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。如果一个项目只是阳性率高敏感性好的话,那么可以认为其阴性结果具备很高的可排除性,仍然有相当的临床适用价值。但PCR的假阴性在检验工作中仍很严重,并且用些因素经常被人忽略,严重的影响了PCR的使用。可以想象一种假阳性和假阴性都很高的项目,有什么样的诊断价值。

造成PCR假阴性的原因是复杂的,也是多样的。主要有:

1、PCR仪本身的质量问题

PCR仪设计原理上的差异和经常出现的质量问题(如:温控不准等)给临床带来了诸如非特异性扩增(假阳性)、扩增效率下降(假阴性)等问题。

2、离心机问题

离心机的质量或使用不正确,造成离心标本模板没有分离出来造成假阴性,窃以为这是最易被忽视的问题。其时离心机使用问题不仅在PCR,在整个检验工作中都是最易被忽视的问题,只是因为在其他工作中不象PCR那样明显影响检测结果罢了。离心机是常用的固液分离设备,其利用离心过程中的离心力而将密度不同的物质分离出来。因此离心机的关键在于离心加速度而不是转速,根据牛顿定律可知离心力加速度与转速和有效半径的有关的,因此对于不同有效半径的离心机相同的转速其离心加速度是不同的,转速的调节要因离心机而异,但很遗憾,日常工作中忽视了这个问题。有效半径短的离心加速度就小,同样的时间离心效果就差可能造成分离不出导致假阴性。同时由于高速离心机高速旋转与空气摩擦会产生大量的热,因此对于称能上几万转/分而没有抽真空的离心机实际转速本人持怀疑态度。

3、试剂开壳剂和操作问题

造成标本DNA没有暴露出来,致使扩增无法进行,这是造成假阴性的又一主要因素。

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