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RFLP的操作要点

标签: RFLP 限制片段长度多态性

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一、 材料

基因组 DNA (大于50kb,分别来自不同的材料)。

二、设备

电泳仪及电泳槽, 照相用塑料盆5只,玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块,吸水纸若干,尼龙膜(依胶大小而定),滤纸 ,eppendorf管(0.5ml)若干。

三、试剂

1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。
  2、5×TBE电泳缓冲液:配方见第一章。
  3、变性液:0.5mol/L NaOH,1.5mol/L NaCl 。
  4、中和液:1mol/LTris?Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
  5、10×SSC:配方见第九章。
  6、其它试剂:0.4mol/L NaOH,0.2mol/L Tris?Cl, pH7.5/2×SSC ,ddH2O,Agarose 0.8%, 0.25mol/L HCl 。

四、操作步骤

1、基因组 DNA 的酶解

(1) 大片断DNA 的提取详见基因组 DNA 提取实验,要求提取的DNA 分子量大于50kb, 没有降解。

(2) 在50μl反应体系中,进行酶切反应:
    5μg基因组 DNA
    5μl 10×酶切缓冲液
    20单位(U)限制酶(任意一种)
    加ddH2 O, 至50μl

(3) 轻微振荡, 离心,37℃反应过夜。

(4) 取5μl反应液,0.8%琼脂糖电泳观察酶切是否彻底,这时不应有大于30kb的明显亮带出现。

[注意] 未酶切的DNA 要防止发生降解, 酶切反应一定要彻底。

2、Southern转移
  (1) 酶解的DNA 经0.8%琼脂糖凝胶电泳(可18V过夜)后EB染色观察。   
  (2) 将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl中脱嘌呤, 10分钟。   
  (3) 取出胶块, 蒸馏水漂洗, 转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。
  (4) 预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物, 以10×SSC盐溶液吸印,维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。
  (5) 取下尼龙膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速转至0.2mol/L Tris?Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分钟。
  (6) 将膜夹于2层滤纸内, 80℃真空干燥2小时。
  (7) 探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。

[注意]

1、 步骤(2)中脱嘌呤时间不能过长。

2、 除步骤(1)、(4)、(5)外, 其余均在摇床上进行操作。

3、步骤(4)中,当尼龙膜覆于胶上时, 绝对防止胶与膜之间有气泡发生, 加盖滤时也不应有气泡发生。

4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异,这时应该试用另一种酶。

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