一、 材料 基因组 DNA (大于50kb,分别来自不同的材料)。 二、设备 电泳仪及电泳槽, 照相用塑料盆5只,玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块,吸水纸若干,尼龙膜(依胶大小而定),滤纸 ,eppendorf管(0.5ml)若干。 三、试剂 1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。 四、操作步骤 1、基因组 DNA 的酶解 (1) 大片断DNA 的提取详见基因组 DNA 提取实验,要求提取的DNA 分子量大于50kb, 没有降解。 (2) 在50μl反应体系中,进行酶切反应: (3) 轻微振荡, 离心,37℃反应过夜。 (4) 取5μl反应液,0.8%琼脂糖电泳观察酶切是否彻底,这时不应有大于30kb的明显亮带出现。 [注意] 未酶切的DNA 要防止发生降解, 酶切反应一定要彻底。 2、Southern转移 [注意] 1、 步骤(2)中脱嘌呤时间不能过长。 2、 除步骤(1)、(4)、(5)外, 其余均在摇床上进行操作。 3、步骤(4)中,当尼龙膜覆于胶上时, 绝对防止胶与膜之间有气泡发生, 加盖滤时也不应有气泡发生。 4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异,这时应该试用另一种酶。 |
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