问题1:无扩增产物 现象:正对照有条带,而样品则无 原因: 1、模板:含有抑制物,含量低 2、Buffer对样品不合适 3、引物设计不当或者发生降解 4、反应条件:退火温度太高,延伸时间太短 对策: 1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2、更换Buffer或调整浓度 3、重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物 4、降低退火温度、延长延伸时间 问题2:非特异性扩增 现象:条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 原因: 1、引物特异性差 2、模板或引物浓度过高 3、酶量过多 4、Mg2+浓度偏高 5、退火温度偏低 6、循环次数过多 对策: 1、重新设计引物或者使用巢式PCR 2、适当降低模板或引物浓度 3、适当减少酶量 4、降低镁离子浓度 5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6、减少循环次数 问题3:拖尾 现象:产物在凝胶上呈Smear状态。 原因: 1、模板不纯 2、Buffer不合适 3、退火温度偏低 4、酶量过多 5、dNTP、Mg 2+浓度偏高 6、循环次数过多 对策: 1、纯化模板 2、更换Buffer 3、适当提高退火温度 4、适量用酶 5、适当降低dNTP和镁离子的浓度 6、减少循环次数 问题4:假阳性 现象:空白对照出现目的扩增产物 原因: 靶序列或扩增产物的交叉污染 对策: 1、操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外; 2、除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 3、各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存。 |
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