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PCR疑难解答

标签: PCR

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当PCR结果不甚满意时,首先检查以下几方面并遵照执行:

将PCR反应的试管与反应板紧贴。

当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时,切记在加入酶后稍微振荡一下,因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。 

不要随意减少dNTP的用量,它是一个系统的因素,必须与其它成份保持平衡。

对于有问题的PCR反应,例如模板的量少,模板不纯和环状模板等,先尝试加Taq酶前的体系进行预变性,后加模板进行正常PCR扩增。 

没有扩增产物: 

在提供MgCl2缓冲液中,以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度;无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。 

泳道中出现模糊条带,如果DNA模板中存在RNA,则按上述提示浓度补加MgCl2,因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。 

检查退火温度和变性条件,如果有需要的话,可降低退火温度。 

检查模板和引物的用量。 

增加循环次数和/或模板DNA的用量。 

泳道中出现模糊条带: 

减少循环次数或模板DNA的用量。

提高退火温度,但不要超过68℃。 

重新设计引物或设计更长的引物。 

其他值得注意的条件:

建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。 

最佳反应体积为50ml,推荐用30ml矿物油覆盖(对盖子加热的PCR仪可以不加)。 

大多数反应中,0.75ml(0.5~1ml)的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。 

建议使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP组合的混合物。然而要得到最佳结果,优化Mg2+的浓度是必需的。 

基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb,传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。

要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。 

降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时,引物长度一般为24~34个核苷酸,溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要,长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

变性:第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间(94℃下进行20--30秒),除非模板中富含GC,则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂,对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时,应该尽可能的降低变性温度。 

延伸:68--72℃下进行延伸操作。 

循环延伸:尽量采用循环延伸的条件,若PCR仪无此功能,则必须增加延伸的时间,例如在扩增10kb片断时,延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。 

长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A,因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆,可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。 

测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性,用Sanger方法进行测序不能产生均一的(染色体)带型。 

引物设计: 

一般长度20-30bp; 

至少50%的GC含量; 

避免引物二聚体和二级结构; 

引物对的Tm值应该接近。 

也可下列图示提示找到解决问题的突破口:

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