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主要程序

(1) 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物;

(2) 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物;

(3) 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA;

(4) PCR扩增生物素化DNA部分。

实验步骤

(1)制备生物素化DNA

将噬粒 BLuescript skt,用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280bp DNa段,即为生物素化DNA。

(2)免疫PCR模式

1. 试剂

包被缓冲液:20mmol/L Tris-HCI(pH9.5),含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3;

洗涤液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5),含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20;

稀释液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5),含150mmol/L NaCl0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA (0.1mg/ml)。

2.操作

(1) 包被

用包被缓冲液稀释抗原(BSA),加入微滴板中(45μl孔),4℃过夜(约15h),用洗涤液洗板3次×5min。

(2) 封闭:

每孔加200μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA(1mg/ml)、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl(pH7.5)(含150mmol/L NaCl缓冲液,37℃温育80min,洗板数次。

(3) 抗原抗体反应:

用释释液1:8000稀释单克隆抗BSA抗体,每孔加50μl,室温(22℃)下45min,洗板孔15次×10min,去除未结合的抗体分子。

(4) 链亲合一蛋白A结合反应:

每孔加入50μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体,室温(22℃)50min,使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上,然后洗板15次×10min,再用无NaN3的TBS洗3次,然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。

(5) PCR

实验条件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI(20℃pH8.3)、1.5mmol/LMgCl2、明胶(10μg/ml)、0.8mmol/LdNTPs(每种0.2mM)、2μM引物(每一引物1μM)和TaqDNA多聚酶(50U/ml)。

PCR周期:

PCR前,用紫外线(UV)(254nm)照射上述反应混合物,然后将之加入到微滴板孔中,每孔40μl,再加20μlUV照射的石蜡覆盖,按下述温度在PCR仪上进行PCR周期:起始变性94℃5min;30个周期:变性94℃5min,退火58℃1min,延伸72℃1min,最后延伸72℃ 5min,得到的PCR产物为特定的261bp的片段。

参考流程

1. 用0.85% NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度;

2. 加50μl于微孔板内,4℃过夜。同时设阴性对照(加50μl 0.85% NaCl于另一孔内);

3. 用400μl的0.05% 温20pBS(以下简称TPBS),洗涤五次;

4. 加入2.25%的100μl正常山羊血清(NGS) PBS封闭2小时;

5. 用含0.15% NGS的TPBS洗3次;

6. 加入100μl用0.75% NGS适当稀释的单克隆抗体(内含100μg的鲜鱼精DNA),室温孵育30min;

7. 用TPBS洗涤五次;

8. 加入50μl适量稀释的生物素化抗鼠IgG抗体,室温孵育30min;

9. 用TPBS洗涤五次;

10. 加入60μl适量稀释的生物素化DNA和亲和素,室温孵育30min;

11. 用TPBS洗涤五次,再用HPLC级水洗三次;

12. PCR扩增:加入50μl PCR反应液(内含T3和T7引物),95℃ 60sec,50℃ 110se,72℃ 110sec,循环30次。取PCR产物10μl于1.7%琼脂糖凝胶上电泳,和核酸分子量标准相比较,在相应的位置邮现电泳带为阳性。必需时将电泳结果照像,进行定量分析。

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