1、实时PCR原理

对扩增产物进行可重复性的定量长期以来一直是科学家和研究者的目标。传统的方法需要对终产物进行凝胶电泳分析。这种方法可以确定目的产物和竞争产物的大小，估算纯度，计算条带强度。然而，所用扩增试剂和体系的变动会造成扩增的终产物的重复性有较大的变动，成为这种方法的主要弊端。

扩增过程的指数期提供给我们最有用的，可重复的数据。在起始的目的DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系。这正是实时扩增的基础。随着DNA内嵌染料和探针特异性化学的发展，实时探测量子学的跳跃发展推动了对扩增过程的研究进展。

今天的实时设备由荧光读数计和热循环仪组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。

原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。

在扩增的每个循环中至少收集一次荧光数据来进行扩增的实时监控。用户能够根据一个一个的循环知道那个样品正在扩增。这些即时的数据允许用户看清楚各个样本相对于标准品，阳性对照和阴性对照是如何扩增的。用户不仅能在扩增过程中监督整个反应，还可以根据反馈的信息来优化相应程序。因此增加了敏感性，特异性和有效性。

正常化后的数据画成荧光值相对于循环数的对数图。

 原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。

样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。

2、 探测化学物质

有5种主要类型的探测化学物质用于实时扩增，包括：

2.1内嵌染料（Sybr-Green I ）

内嵌染料，例如Sybr-Green I ，能与双链DNA结合

a) SG不与单链DNA结合，荧光信号强度较低

b) SG与双链DNA结合，荧光信号强度极大的增强

SG是一种荧光染料，能结合到DNA双螺旋的小沟。处于溶解状态的未结合染料显示低的荧光强度，一旦结合到双链DNA之后荧光信号增强。这种特性被利用在实时扩增中。由于在扩增反应中DNA增加，染料结合到扩增产物上，荧光信号增强。荧光信号相对背景水平的增加进行分析。根据扩增子的长度有多个荧光染料的分子结合到双链DNA上。内嵌染料可以和所有其他传统扩增成分，例如水，缓冲液，MgCl2，dNTPs,Taq-聚合酶，引物和模板一起加到扩增反应管中。因为不需要设计序列特异性探针和新的引物对，这种方法是一种简便，性价比较高的实时监测方法。

内嵌染料没有序列特异性，可以结合到包括非特异产物和引物二聚体在内的任何dsDNA上，因此有必要区分目标信号和假信号。内嵌染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，实时仪器连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链，可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。

溶解峰反映了反应中扩增到的产物。这些峰是凝胶电泳中条带的类似物。因此，用溶解曲线数据对SG反应后的产物进行质量监督。

2．2双标记探针

双标记探针是一种短的寡核苷酸序列，5‘末端连接有荧光报告染料，3‘端连接有荧光淬灭分子。由于这种探针只有15-25bp长，报告基团和淬灭基团紧密接近，几乎探测不到荧光信号。在循环过程中，Taq DNA聚合酶对每个引物进行延伸。DNA聚合酶具有外切核酸酶活性，因此在延伸过程中会切除下游的探针。一旦探针被降解，报告染料就会与淬灭分子相分离。

a)  报告染料R发射的能量被淬灭分子Q所吸收和淬灭。

b)  聚合酶的外切核酸酶活性通过水解方式将报告染料与淬灭分子相分离导致了荧光信号的增加。

在每个扩增循环由于切开了探针因此实时设备探测到报告染料的增加。由于报告染料被切开，因此不能进行溶解曲线分析。双标记探针比内嵌染料有更高的特异性，这里有2个原因。首先，双标记探针具有序列特异性，只结合到互补区。第二个原因是双标记探针对每扩增的一个拷贝只释放一个分子的荧光染料。由于双标记探针增加了特异性，这种探测方法很适合检测低拷贝数的模板。

2．3．FRET 探针

FRET 探针依靠荧光能量从一个荧光染料到另一个的传递。两个独立的特异寡核苷酸序列都标记上荧光基团。上游探针在3‘末端有一个供体基团，下游探针在5‘末端有一受体基团。设计探针时他们在与目标序列结合时互相临近，使供体和受体荧光基团紧密接近。一旦探针杂交到模板上，从供体到受体荧光基团的能量传递产生了一个不同波长的荧光信号。供体荧光信号的减弱和受体荧光信号的加强都能分别监测到。因此，只有当两个探针都结合上去才能检测到荧光信号。FRET 探针可以进行溶解曲线分析，对基因型分析，SNP检测和其他突变检测非常有用。

a)    扩增循环中，两个探针与靶DNA退火

b)    供体被外部光源激发通过能量传递导致发射荧光的产生。

2．4 分子信标

第四种检测方法是分子信标（MB）。这种探针的基本特征是有一个发夹结构，在此结构的一个末端有一个荧光染料报告基团，在另一个末端有一个淬灭分子。

这个发夹结构能使MB探针在不杂交时保持折叠状态，报告基团和淬灭分子处于极端接近的距离，几乎没有荧光信号发出。然而，当MB与模板杂交时，发夹结构被破坏，发色团不会被淬灭。在这个时间点，实时仪器能探测到荧光信号。用MB探针也可以进行溶解曲线分析。

a)  分子信标的发夹结构淬灭了荧光信号

b)  杂交后开始发射荧光信号

得益于实时探测技术的实际应用数量和应用类型影响深远。其中的一些益处包括有机体的鉴定，诊断性检测，基因表达研究，突变检测，SNP检测，基因型和微阵列结果确证等。每种不同的化学物质根据应用的不同会提供给用户不同的便利。应该注意的是，得益于实时探测技术并建立在荧光化学物质基础上的还有其他检测核酸的等温扩增系统。

2．5   AmplifluorTM直直接基因系统

AmplifluorTM直直接基因系统基本特征是激发的荧光进行分子能量转移到受体成分导致荧光发射的淬灭。目标特异性AmplifluorTM直引物包含一个5‘内部互补序列，标记有荧光发色团（fluorescerin）和一个能量受体：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。发夹结构的3‘端序列是目标特异性引物区。未结合的AmplifluorTM直引物由于内部荧光发色团和淬灭分子的紧密接近，只有低的荧光信号。进一步的信息可查阅网站www.intergenco.com。

在第一个循环中，Amplifluor引物1与特异CDNA的第一条链退火并被Taq酶延伸。在第二个循环中 Amplifluor引物1延伸产物作为引物2（反义链引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor发夹引物解折叠并产生荧光信号。随后的扩增循环中产生的荧光信号的增强与扩增产物量的增加成比例。

3、   SG, 双标记探针和FRET探针的优化

3．1 SYBR-GREEN I (SG)

为优化SG反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl2,dNTP和Taq酶浓度等）。结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。

SG分析的优化主要包括以下4个因素：

a) SG浓度

为获得合适的SG浓度应该做一下不同稀释度的实验。就像上文描述的那样（章节2.1），SG的原则是嵌入dsDNA中，因此SG直接关系到扩增反应的情况。过高的SG浓度会抑制反应。相反，SG浓度不够会导致没有足够的SG来标记扩增子。合适的SG浓度应该有一个折衷的考虑。

推荐的SG终浓度变动范围是1：5000到1：100000。经常用到的浓度范围是1：10000到1：70000。

SG优化分析

SG浓度范围是1;30000到1：400000。原始数据（a）展示了前四个稀释度（1：30000，1：40000，1：50000，1：60000）出现最大的荧光信号增强，而下一级的稀释度（1：125000，1：250000，1：300000，1：400000）出现较低的荧光信号增强。溶解曲线数据（b）得出相同的结果。在图（c）中定量数据显示最低的Ct值属于样本1：40000，1：50000和1：60000。选取1：50000做进一步的实验。

优化分析的目的是找到最适SG浓度，确保没有引物二聚体产生，同时获得最强的荧光信号增加和最低的Ct值。

b) 引物浓度

引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范围应该是50nM到300nM，然而，也有例外的情况。应该在固定DNA模板量的情况下作一系列的稀释度，同时也要在没有模板的对照组（NTC）作相同的稀释度。针对于具有DNA模板的给定反应的最适引物浓度应该得到低Ct值和荧光信号的高增长（5到50倍），同时没有DNA模板（NTC）的对照体系具有低Ct值。发生在NTC中的扩增是由于形成引物二聚体和非特异扩增产物。

同时也应该做这两种反应的溶解曲线。对于有DNA模板的反应应该得到单一的峰，在较低的溶解温度也没有其他峰出现。在较低的溶解温度出现其他峰可能是反应中引物浓度过高。引物的量应该适当减少。

推荐用HPLC纯化后的引物。虽然对扩增产物没有太大差别，但对于NTC可能有较大的差别。用未纯化的引物得到的扩增曲线可能导致Ct值的较大差异。纯化后的引物相比于未纯化引物有更好的敏感性。这对于SG反应尤其重要，因为非特异产物导致阳性对照品中的SG信号。另一方面也有报道说纯化引物和未纯化引物没有差别，可能与个别反应有关。

C) MgCl₂ 浓度

如上所述，SG反应能探测所有双链DNA。与可以容忍非特异扩增产物和引物二聚体的双标记探针相比，能扩增出特异产物对于SG反应非常重要。这可以通过降低反应体系中的MgCl₂用量来获得。

获得最适MgCl₂浓度的理想方法是做一系列的稀释度。检测到MgCl2的最低终浓度是1.5mM。做各种稀释度时应该包括NTC。

D)模板和反应次数

另一种优化反应的方法是选择扩增的最适温度。三个温度很重要：变性，退火和延伸温度。对于变性温度我们推荐95度，延伸温度推荐用72度，根据所用酶的不同这个温度可以变动，请参考生产者的推荐书。然而退火温度对反应有动态的影响，为了找到最适退货温度首先咨询生产引物的公司。除非例外，还需要额外的优化，这通过检测不同的退货温度来获得。一般而言，温度越高，反应特异性越好。

扩增反应所用的时间也很重要。最适于SG的延伸时间很难预测。基因组DNA相比于质粒DNA需要较长的变形时间，较短的扩增子相比较长的扩增子较短的延伸时间已经足够。对于扩增子长度为200-300bp的给定CDNA扩增反应我们推荐以下的程序：

此程序只是一般的推荐，退火温度还需要调整。关于优化扩增反应在f部分有进一步的建议。

e) 使引物二聚体消失

这一部分描述了即使出现引物二聚体，如何在Roter-Gene上获得好的数据。虽然以上描述的优化步骤都应该履行，Roter-Gene上的软件的一个功能可以让我们在原始数据屏幕和定量屏幕上看到减少的引物二聚体数量。一旦感兴趣基因和引物二聚体的溶解温度确定下来，可以引入第四步¬¬—temperature profile（温度描绘）中的一个功能。通过按压edit profile中的“+”，在profile中简单加一个额外的温度步骤，在引物二聚体溶解温度以上，扩增子溶解温度以下的温度点获得数据。这个额外步骤应维持15秒。由于温度比较高，增加非特异产物不太可能。由于在2个温度都获得数据，有可能确定结果之间的差别。

从2个不同温度获得数据的SG反应，循环A和循环B分别在72度和84度获得数据。红色，桔红色和棕色曲线分别代表6种不同的DNA浓度，蓝色样品代表合适的NTCs。在循环A中看不到NTC，循环B中看不到非特异扩增产物。溶解曲线显示DNA产物在右侧，NTCs在左侧。

f) SG反应中的小窍门和经常会问到的问题

1）尽管有以上的优化步骤，有时候反应还不能正常进行。这主要源于DNA的纯度，可能是PCR抑制物使扩增反应不能进行。一个检测反应抑制物的可能办法是将反应混合物与已知模板和适当引物混合，如果不能反应则可能是抑制剂的原因。

2）如果SG反应不能正常进行，有报道说0.025%Tween-20对SG反应有利。

3）通常SG稀释在水或TE缓冲液中。将SG稀释在DMSO中有可能解决一些研究者在贮存稀释后的SG时遇到的问题。

4a) 关于制备个人用10*SG Master

混合：
　　100mM Tris pH 8.3
　　500mM KCl
　　0.1% Tween-20
　　 8%Glycerol
　　10*SG (依赖优化的结果)

4b) 下列的Master Mix由Morrison et al.报道，Biotechniques(1998)24(6):954

50mM Tris pH 8.3

3mM MgCl2
　　0.5 mg/ml BSA
　　0.33*SG(从分子探针)（或者你的优化浓度）
　　50Units/ml HotStarTaq-polymerase(Qiagen)
　　50nM 到 300nM/每个引物
　　总共20微升的反应体系含一微升模板

5）为了在SG反应后作溶解曲线，引入与溶解曲线起始温度点相同的保温步骤（大约60秒），这样可以确保溶解温度起始于一个确定的温度。

6）溶解曲线分析可以重复。可以在相当一段时间内重新作溶解曲线，甚至到第二天也可以。

7）关于可以用SG检测的引物对的列表，请查询www.realtimeprimers.org

8) 进行SG分析的典型程序是什么？

变性：检查反应所用的酶（2min,5min,10min或15min）
　　循环：95度/20秒，退火温度/20秒，72度/20秒
　　保温：72度/60秒
　　溶解：72-99度，on Melt A
　　要获得更多的细节请参考3.1.4
       
9)在哪个通道SG可以被检测？

发射:：470nm
　　检测：510nm
　　(双通道机型/多通道机型)
　　发射：470nm
　　检测：585nm
　　(多通道机型)

10）SG的稳定性如何？

只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。

11）随着mRNA和随后得到的cDNA和DNA的数量和质量的提高，检测到低拷贝数的能力会增强。用到的引物浓度通常是50nM到300nM。

12）利用SG作溶解曲线分析的结果会因以下的因素而有所差别：a)产物的大小 b)产物的GC含量。由于以上的因素单核苷酸多态性（SNP）有可能检测不到。

13）推荐用HPLC纯化引物。虽然对于复制子的扩增没有太大影响，对NTC可能会有很大影响。

14）尽管更长的扩增子也能进行反应，最适的扩增子长度应该是100-200bp。

15）由于很多因素的影响扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2浓度和其他因素的影响。要做溶解曲线的对比你首先要确保所用的条件相同。

16）使用SG的一个主要不利因素是引物二聚体的非特异扩增。我们最近利用Qiagen的QuantiTectTM SYBRR Green PCR试剂盒得出相当好的结果。重复试验的结果非常接近，NTC根本没有出现扩增。这个试剂盒对于利用SG扩增低拷贝数的模板非常有用。

3．2 双标记探针

双标记探针的优化比SG优化容易。最重要的事情，也就是需要优化的是引物/探针浓度和它们的比例。最适的MgCl2浓度通常是4-5mM (终浓度)，然而商业上可买到的Master Mixes用到7.5mM (终浓度)。

荧光探针的设计直接关系到实时监测的成败。下面的规则总结了设计引物和双标记探针应该考虑的一些建议。

a) 针对双标记探针的引物和探针设计的规则

所选序列应该高度特异。应该选择具有最小二级结构的扩增子。这是很重要的，因为二级结构会影响反应效率。在任何实时应用中期望获得100%的扩增反应效率，这意味着每次循环中，体系内的扩增子都有两倍的增加。如果二级结构在热力学上比寡聚目的基因更稳定，那目的基因的杂交将会失败。二级结构还会阻碍酶的扩增。我们推荐可以去以下网址进行二级结构的检测，www.bioinfo.math.rpi.edu/mfold/dna/forml.cgi.也可以去下面的网页c2.biomath.mssm.edu/trf.html进行前后验证。如果扩增子的二级结构不能避免，则引物的退火温度要相应提高。在整个过程中，我们要进行BLAST和类似的分析，以确保特异性。

通用原则

1，  先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。

2，  扩增子的长度应不超过400bp，理想的最好能在100－150bp内，扩增片断约短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性

3，  保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，及在SG分析中非特异信号。

4，  为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）

5，  将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

b）探针设计指导

1，在设计引物之前设计探针

2，探针的Tm值应在68－70℃之间，如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区。

3，探针的5’端要避免有鸟氨酸，5’G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在

4，选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

5，探针应尽可能的短，不要超过30个bp。

6，检测探针的DNA折叠和二级结构。

c) 引物设计指导　

1，引物的Tm值应在58－60℃之间，这非常重要，因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃，在这个温度下，5’核酸外切酶的活性最高。

2，引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

3，将引物尽量接近于探针

d) 循环参数

当引物和探针按照上述原则设计好后，循环的参数也就确定了，当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定)，反应要经过95℃，15－20秒，60℃60秒，对于一些模板，45秒也足够了。数据在退火时检测。

e) 怎么优化探针和引物的浓度

对于双探针反应，通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果，，能获得最低的CT值，以及相对于背景来说荧光值有最高的增长。

引物浓度应该在50nM  -900nM 范围内进行优化，下面的表格显示了前后引物9种可能浓度组合的结果

探针浓度应该在50－250nM范围内优化

                      前引物
　　后引物             50            300              900
   　　 50              50/50       300/50        900/50
   　　300             50/300     300/300     900/300
 　　  900             50/900     300/900     900/900

探针的浓度应该从（50，100，250nM）与9种引物浓度相组合，也既是27种可能根据前面所述的循环参数，在Rotor-Gene上进行试验，选择最小CT值和最高反应扩增的曲线做后续试验。

g) 进一步的提示

通常所用的探针和引物浓度分别为250nM 和900nM，绝大多数反应都可以在这个浓度下进行，但为了寻找最佳的浓度，还是应该依照上述的步骤。

由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序，因此使用三种退火温度（58，60，62℃）对优化是很有用的。

引物的浓度也会影响溶解温度，高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。

我们可以从以下网站获得探针，引物设计软件。www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.www.cgi Primer3是个非常有用的软件，但他不能避免3‘端的G，所以我们将3’端的G去除，并观察探针的退火温度是否比引物高8－10度。

f) 定量数据的分析

研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据

i)    绝对定量

绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品，关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论，理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得，然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因，并与未知样品比较。要注意得是，绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。

在Rotro-Gene 上可以用几种方法来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的，R值，反应效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整，（或重复相同的标准品），这个功能在确定斜率的重复性好与Y截距的基础上完成。对一个标准曲线来说，一个单独的标准品就已经足够了。我们也可以在不同的通道甚至一个通道内绘制多条标准曲线。最后提到的功能主要是为了那些想用SYBR-Green分析两个基因的使用者。

ii)相对定量

相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率。没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的方法叫“比较CT值法（ㄓㄓCt）

这种方法可以彻底不需要标准曲线，通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平（normalizer），从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种方法成功，目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的方法就是看ㄓCt（相同的起始模板浓度，两个扩增子的两个CT值的差异）随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同，则the plot of log input amount versus ㄓCt 将是一条水平线（斜率<0.01）。这以为着在初始模板浓度范围内，两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致，则应该用标准曲线来对基因表达进行定量，或优化反应使得获得一个类似的效率。动态范围应该有下面两点决定   （1）目的基因使用最小和最大的浓度其结果都是准确的

（2）两个基因的最小和最大的定量比值都是准确的）

将目的基因和内参照在不同的管中扩增使用标准曲线法是最少需要优化得。

使用比较CT法的优点就是可以不需要标准曲线。也可以排除在创造标准曲线时因为稀释误差而引起得副作用。只要目的基因及参照物有着类似得动态范围，则比较CT值法是最有效的方法。我们希望校正物比目的基因有较高得表达水平（较低的CT值），定量得计算就是获得目的基因和校正物间的CT值差别（ㄓCt）开始得。

ㄓCt＝Ct(目的基因)－Ct（校正物）

对每一个要被定量的样品，这个值都被计算（如果目的基因值比校正物值高，则是正值，而如果是个负值也是可以得）应该选择一个样品作为参照（基线），这样其他样品都与其相比较。相比较的ㄓㄓCt包括了每个样品间ㄓCt值的差异，及与基线相比较的差值。如果基线代表了最小的表达水平，则ㄓㄓCt应该是负值，因为基线样品的ㄓCt是最大的，因为它有最大的CT值。如果有些样品的表达水平是升高，而另一些下降，则ㄓㄓCt是个负值和正值得混合。定量的最后一步就是将这些值转换成绝对量，相对表达量的公式是2-ㄓㄓCt

下面的网址提供了这种方法得具体介绍dos.appliedbiosystems/pebiodocs/04303859.pdf 

h) 使用双标记探针进行多重反应

我们可以在ROTOR-GENE上进行多重反应，因为它可以检测多种荧光。一个管内最多可以检测4种荧光，在ROTOR-GENE上可是使用FAM,JOE ,ROX CY5(想要进一步了解荧光素，可以去看FAQ)

最常用到的多重扩增反应是对基因表达的定量。一个标记FAM的探针来检测看家基因，而用别的的荧光素标记来检测同一个反应管中的另外1，2，甚至3个不同基因，在一个管中进行四重反应，不仅可以降低反应成本，同时也可以降低对将样品分装到2至4个管中时加样准确性的依赖。

为了进行一个多重反应，要确保一个目的基因的扩增不会影响另一个。一个目的基因的主导性会降低另一个相对量少的目的基因得扩增效率。这可能会导致不正确的结果，甚至会完全抑制了对相对量少的目的基因的检测。

为了决定引物限制浓度，应该使用终浓度20Nm到100nM之间进行几个反应，这样做得目的在于不影响CT值的前提下，尽量降低背景之上荧光值的增长。

使用双标记探针的扩增反应的Mg离子浓度要比一般反应中的高，因为Tag酶得5’-3’外切酶的作用需要较高得Mg离子浓度。由于双标记探针需要5’-3’酶活性，必须要高Mg离子浓度（最少3.5nM,一般5nM）

i)    使用双标记探针进行突变检测

为了检测突变体，要设计两种不同颜色的探针。一个探针设计来检测野生型，可以标记FAM，同时设计另一个标记JOE的探针来检测突变体。通常两个探针的差别只有1个bp，由于两个探针相差极小，因此推荐使用严格的反应条件。

选择“analyse”和”Allelic discrimination”来分析数据，两个通道的结果会呈现在一个屏幕中，没有标记物的曲线是CH1结果，有循环数的是CH2，最多可以有四个探针(两个突变体)可以被分析，在编辑好基因型名称，将域值调整到0以上后，结果就会在图下方的表格中显示出来。

j)   RT-扩增

有一些扩增反应在ROTOT-GENE上进行反应之前，有一个RT步骤，SG和双标记探针都可以完成。最近有一篇综述“Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays”,可以去johurnals.endocrinology.org/jme/025/jme0250169.htm

k)  看家基因

由于DAN/RNA量不同，基因表达的定量分析都要与一个初始参照基因想比较。对于RNA的量，由于组织，细胞数目，试验步骤，或RNA抽提效率的不同，会有很大的波动，下面一篇文章就很好的告诉你，你的看家基因是否适合你的需要。

Schmittgen TD， Zakrajsek BA . Effect of experiment treatment an housekeeping gene expression validation by real-time quantitative RT-PCR.J Biochem Biophys Methods 2000NOV 20:46（1－2）：69－81

这里还有一些经常被使用的看家基因：beta-actin, GAPDH， cyclophilin,18sr RNA ,phosphoglyserokinase,beta-microglobulin,beta-glucronidase,hypoxanthine ribosyl transferase,transferring receptor 及另外一些。要注意看家基因可以被反应调节所影响，在设计定量表达研究时，保证初始对照基因的质量是必须得。

l)    一些关于储存的建议

双标记探针可以保存在－80℃至少一年，在使用前将干粉稀释成已知浓度的储存液， 然后分装在－20℃度保存。取出所需要的微量管中的探针溶解，放在冰上，直到使用时再打开。如果每天都使用，则探针储存液应该用HPLC水稀释到一个恰当的浓度，TE 溶液，或10mM Tris(ph7.5).如果想长期保存探针，可以在稀释液中加入0,01%Tween 20和0.01%Gelatin。这样保存的探针可以一年或更长时间内不会降解。为了确保光学活性和最大反应结果，荧光探针都要避光保存。