支原体菌株来源:M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体,M.FermentaneATCC19989发酵支原体 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原体 ,M.HominisATCC23114人型支原体 ,M.OraleATCC23714口腔支原体 ,M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体。其共同引物序列来自16s和23s保守区域,外部引物为F1 5′-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3′,R1 5′-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3′;内部引物为 F2 5′-GTTCTTTGAAAACTGAAT-3′,R2 5′-GCATCCACCAAAAACTCT-3′。 PCR反应体系和条件:10×缓冲液(10mMTris-HCl、500mMKCl、20mMMgCl2、0.01%明胶)、PrimerF1、R1、F2、R2的浓度为2nmol/μL、2.5mMdNTPs、Taq酶、H2O、石蜡油覆盖。反应温度和时间为:94℃/2min预变性、94℃/30s变性、55℃/1min退火、72℃/1min延伸,循环30次后72℃延伸5min。第1次PCR反应取模板10μL,第2次PCR反应以第1次PCR扩增产物为模板取1μL。 下面有更详细的污染测试——支原体:PCR方法 原理:利用具特殊专一性之primers,经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列,由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同,因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。 特点:灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU/5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组,避免可能之污染。 缺点:PCR反应很灵敏,易有伪阳性结果。此方法尚在评估中,故结果仅作为参考和内部品管之一部份。 材料与设备: 方法: 此PCR反应是一种nested PCR,包括2阶段PCR反应,1st stage PCR结束后,取其反应物作2nd stage PCR,然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis,依DNA band之有无及片段大小来分析结果。 结果:使用UV light观察,并照相记录。 不过应用较多还是巢式PCR 方法: 此PCR反应是一种nested PCR,包括2阶段PCR反应,1st stage PCR结束后,取其反应物作2nd stage PCR,然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis,依DNA band之有无及片段大小来分析结果。 结果:使用UV light观察,并照相记录。 方法再详尽点: |
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