PCR技术的发明

1983   Kary Mullis 发明

1985  开始有文章发表

1993  获诺贝尔奖

广泛用于分子生物学研究领域

变性--退火--延伸三个步骤

1、模板DNA的变性：93℃-95℃左右

2、模板DNA与引物的退火(复性)：Ta=Tm-3~5 ℃

3、引物的延伸：Taq DNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性

PCR标准反应体系

DNA模板
      p引物
      p反应缓冲液
      pMg 2＋
      pdNTP
      p耐热聚合酶
      pddH2O

反应体系对PCR扩增的影响

1、DNA模板:

纯度      蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应
      完整性    模板降解会导致PCR扩增无产物
      浓度      浓度适当

2、引物

设计      长度适当、避免二级结构和二聚体
      合成质量
      浓度      50uL体系引物加量为10-20 pmol

3、反应Buffer

pH、盐离子、稳定剂、增强剂
      提供缓冲环境

4、Mg 2＋浓度

过高非特异性严重
      过低无扩增产物

5、dNTP Mixture

浓度适当，避免反复冻融

6、ddH2O

pH值适当，避免污染

如何选择最合适的DNA聚合酶

1、Taq酶——扩增效率最高发现
      1969年，美国黄石国家公园温泉

活性

5‘-3’ DNA聚合酶活性   强
      5‘-3’ DNA外切酶活性   弱  荧光探针（定量PCR方法）
      3‘-5’ DNA外切酶活性   无  错配率每个循环约1/6000
      3‘末端加“A”  能   产物可直接进行“TA”克隆

生产质检

诱导大肠杆菌表达、三次柱纯化，分离获得94kD重组蛋白。
      无核酸酶和细菌DNA污染
      能有效扩增人基因组单拷贝基因
      室温放置一周，无明显活性改变

2.pfu酶——保真度高

原理

具3’－5’核酸外切酶活性，即校正功能。
      效率相对较低
      3‘末端不加“A”，加A后才可进行TA克隆。

用途

–表达基因的克隆
      –基因的定点突变
      –细胞内基因点突变分析（SNP）

3.HotStart  Taq酶——特异性高

原 理

–蜡封
      –抗体抑制
      –化学修饰
      提高PCR特异性，减少甚至避免非特异性扩增
      3‘加“A”，可直接做“TA”克隆

用 途

–混杂模板
      –半定量、定量PCR

4.混合酶——高扩增效率＋高保真度

Taq  plus

Taq+pfu
      用于复杂模板（GC rich, 二级结构）扩增
      大多数情况下可替代Taq, 特别是产物在6Kb以上时，可扩10-20kb

Long  Taq

Taq+pfu
      超长片断扩增，15-40kb

Taq  platinum

HotStart+pfu
      高扩增效率＋高保真度

根据PCR实验的不同需求

基因组扩增、RT-PCR  ———————  特 异 性
      基因突变、测序、 表达克隆————— 保 真 性
      构建基因图谱、测序等——  长片段扩增
      复杂模板扩增 (GC含量高、二级结构) —扩增效率

PCR MasterMix

PCR Master Mix 产品特点

特 点

• 快速简便   减少加样误差和污染
      • 灵敏度高   可扩增低至2个拷贝的目的模板
      • 特异性强   降低PCR反应的要求，增强特异性
      • 稳定性好   -20℃一年以上，反复冻融不影响活性

适用范围

•  大规模基因检测
      •  目的基因拷贝数极低的样本
      •  GC含量高,有二级结构的模板
      •  复杂基因组样本

PCR常见问题分析

PCR常见问题

1、无扩增产物

①无扩增产物之模板原因
      ②无扩增产物之引物原因
      ③无扩增产物之PCR条件原因

2、非特异性扩增或拖尾

现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带

3、假阳性

现象：空白对照出现目的扩增产物

提高PCR特异性的策略

四种策略

1、巢式PCR（Nest-PCR）

2、递减PCR（TouchDown PCR）

–前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性
      –循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃
      –特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势
      –递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等

3、热启动PCR（HotStart PCR）

–热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度
      –通常选择热启动Taq酶
      –热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一

4、使用PCR增强剂

–甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等
      –可能的机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区
      –增强剂浓度要适当