1. SG浓度: 终浓度1:5,000-1:100,000,一般为1:10,000—1:70,000
2. Primer浓度: 终浓度50nM-300nM 固定摸板浓度的梯度实验 不加摸板的对照实验(NTC)——有无非特异信号 熔解曲线的分析——是否单峰 建议使用HPLC纯化的引物
3. MgCl2浓度 降低MgCl2浓度以减少非特异性产物 最低可至1.5nM 同时做梯度实验和NTC对照
4. 反应温度和时间参数 反应温度参考所用酶的种类 退火温度使用温度梯度功能优化 反应时间与常规PCR类似,扩增片断一般为200-300bp
5. TaqMan探针 引物、探针设计: 首先选择探针序列 探针的Tm值为68-70度,长度不应超过30碱基 探针的5’端不应是G,G有可能会淬灭荧光素 引物应尽量靠近探针,扩增片断不超过400bp,通常为80-150bp 引物的Tm值为59-60度,长度约20碱基 避免引物、探针之间的二级结构
委托合成公司设计 使用辅助软件 确定反应参数 一般为两步法,94度10-20s 60度30-60s (Taq酶的5’外切酶活性在60度最强) 通过温度梯度优化退火温度 三步法, 72度45s 优化引物探针浓度
目标:最高的信号/背景比 最小的Ct值 引物浓度:50nM-900nM 探针浓度:50nM-250nM 通过多次实验确定各自的浓度和比例
|