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Primer 3 在线引物设计攻略(图)

标签: Primer3 引物设计

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开始之前:其实非常简单,不需要你下载任何软件,但是你得有一台电脑能上网。当然,最重要的是,你要很清楚用于做引物的模板序列,至于怎么找模板序列,不再本次讨论范围。另外,要先对PCR目的序列的长度有个大致估计,好了,马上开始吧:

第一步:找到Primer3的站点。你不用记住这个站点,但是要记住“Primer3”这个词,然后打开GOOGLE首页,输入Primer3,跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0 ”,网址是http://frodo.wi.mit.edu/。

第二步:贴上模板序列。进入Primer3站点,可以看到一个引物设计的界面。(如下图)在“Paste source sequence below (5'->3'…”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的,数字或者空格都没关系,软件会自动过滤的。

第三步:重要参数设定。首先是“Product Size Ranges ”,如果你不希望软件给你随便做的话,首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000,这个你得自己改,如果你希望产物的大小符合你的预期,尽可能把范围改小,比如480-500,具体看情况调整。第二个参数是“Primer Size”,默认值一般可以用,但是,当你用熟了这个软件,你自己就知道该怎么改了。第三个参数是“Primer Tm ”这个和Primer Size差不多。

第四步:Pick primers: 点一下这个按钮,符合你大小预期的primer就出来了,看看Primer3 Output的界面,多么漂亮!你要的primer出来了,而且有primer在序列上的位置比对图,还要primer本身的信息,包括位置,长度,Tm,GC含量,任何位置互补碱基数,3'端互补碱基数,以及引物序列,(注意,下游引物是5'->3'),还要产物大小,两引物间任意互补碱基数,两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内,但还不是最佳,将会给出警告。

比如(随便举例,本人在做一个超长引物):

WARNING: Left primer is unacceptable: High 3' stability

OLIGO                start     len    tm       gc%     any     3'        seq 

LEFT PRIMER       1           33   69.02  45.45   6.00   1.00   TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCC

RIGHT PRIMER    1388      34   67.86   29.41   6.00   2.00   AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACAT

SEQUENCE SIZE: 1388

INCLUDED REGION SIZE: 1388

PRODUCT SIZE: 1388, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 3.00

第五步:引物设计检验:可以仅仅设计一对引物,只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物,放在Primer框里,(注意,下游引物的书写反向仍然是5'->3')如果符合设定的条件,软件将对给出引物评分,同时给出警告信息,根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可,警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物,最好都要检查一下,这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCR所用的引物,最好是使得产物跨过内含子,这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。实际做引物的时候,要把内含子都去掉,仅仅把外显子序列放入源序列框中,并且通过自定义引物设计的方法,使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR,将另做说明。

至于设计出来的引物的实际效果,根据我的经验,一般情况下都能做到PCR一次成功,也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果,但是不管怎么说,软件做引物可以让自己心中有数。最后,GOOD LUCK TO EVERYONE.

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