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大肠杆菌诱变处理与营养缺陷型筛选

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【实验目的】

1.了解应用物理、化学因素对细菌进行诱变的方法。

2.初步掌握诱变产生营养缺陷型菌株的筛选与鉴定的技术。

【实验原理】

在以微生物为材料的遗传学研究中,用某些物理因素或化学因素处理细菌,可诱发基因突变。如果突变后丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的能力,不能在基本培养基上生长,必须补充某些物质才能生长,称为营养缺陷型。实验室获得营养缺陷型菌株通过经过以下几个步骤:诱变处理、突变型筛选、缺陷型检出,缺陷型鉴定。

诱变处理首先要选择诱变剂,诱变剂可分为物理和化学两类。微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。

进行诱变处理时为了避免出现不纯的菌落,一般要求微生物呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液,分布均匀。试验表明处于对数生长期的细菌对诱变剂的反应最灵敏。

诱变处理必须选择合适的剂量,不同微生物的最适处理剂量不同,须经预备实验确定。物理诱变的相对剂量与三个因素有关:诱变源和处理微生物的距离、诱变源(紫外灯)功率、处理时间,往往通过处理时间控制诱变剂量。化学诱变剂的剂量也常以相对剂量表示。相对剂量与三个因素有关:诱变剂浓度、处理温度和处理时间。一般通过处理时间来控制剂量,在处理前对诱变剂和菌液分别预热,当二者混合后即可计算处理时间,可精确控制处理剂量。

经处理以后的细菌,缺陷型所占的比例还是相当小,必须设法淘汰野生型细胞,提高营养缺陷型细胞所占比例,浓缩缺陷型细胞。浓缩缺陷型的方法有青霉素法、菌丝过滤法、差别杀菌法、饥饿法等,这些方法适用于不同的微生物。细菌中常用的浓缩法是青霉素法,青霉素是杀菌剂,只杀死生长细胞,对不生长的细胞没有致死作用。所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死,缺陷型不能生长,可被保存得以浓缩。

检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。这里主要以逐个测定法为例进行说明:把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上,待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。

经初步确定为营养缺陷型的菌株用生长谱法鉴定。在同一培养皿上测定一个缺陷型对多种化合物的需要情况。

【器材与试剂】

一、器材

离心机,紫外线照射箱,冰箱,恒温箱,高压灭菌锅;三角烧瓶,试管,离心管,移液管,培养皿,接种针等。

二、试剂

肉汤液体培养基,ZE肉汤液体培养基,基本固体培养基,基本液体培养基,无N基本液体培养,2N基本液体培养基(成分及配制方法见后)。

20种基本氨基酸,7种微生素(硫胺素,核黄素,吡哆醇,泛酸,对氨基苯甲酸,烟碱酸,生物素),嘌呤,嘧啶;亚硝酸钠,青霉素钠盐,冰乙酸,乙酸钠,氢氧化钠,硫酸镁,蔗糖;生理盐水,0.1mol/L醋酸缓冲液(pH=4.0),0.1mol/L NaOH。

混合氨基酸(包括核苷酸)共分7组:其中第Ⅰ到第VI组各有6种氨基酸(包括核苷酸),每种氨基酸(包括核苷酸)等量研细充分混合;第VII组为脯氨酸,因容易潮解,故单独组成。各组具体组成如下:

I. 赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、嘌吟
      II. 组氨酸、精氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸(或甘氨酸)、嘧啶
      III. 丙氨酸、甲硫氨酸,苏氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸
      IV. 亮氨酸、半胱氨酸,谷氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、缬氨酸
      V. 苯丙氨酸、胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、酪氨酸
      VI. 色氨酸、嘌呤、嘧啶、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸
      VII. 脯氨酸
      混合维生素:把硫胺素、核黄素、吡哆醇、泛酸、对氨基苯甲酸、烟碱酸及生物素等量研细,充分混合即可。

【实验步骤】

一、菌液制备

1.菌体的活化与培养

实验前14~16h,挑取少量K12SF+菌,接种于盛有5ml肉汤培养液的三角瓶中,37℃培养过夜。第二天添加5ml新鲜的肉汤培养液,充分混匀后,分装成2只三角瓶,继续培养5h。

2 收集菌体

将两只三角瓶的菌液分别倒入离心管中,3500rpm离心10min,弃去上清液,打匀沉淀,其中一管吸入5ml生理盐水,然后倒入另一离心管,二管并成一管。

二、诱变处理

1.紫外线诱变法

(1)处理前先开紫外灯(15W)稳定30min。 
      (2)吸取菌液3ml于培养皿内,置于紫外灯下,距灯管28.5cm处;先连盖在紫外灯下灭菌1min,然后开盖处理1min(处理时间依70% 的杀菌率而定);照射后先盖上皿盖,再关紫外灯。
      (3)吸取3ml加倍肉汤培养液,注入处理后的培养皿中,37℃恒温箱内避光培养12h以上。

2.亚硝酸诱变法

(1)吸取菌液1ml于离心管中,冰冻1h,制成静止细胞。
      (2)加入5ml 醋酸缓冲液(pH=4.0),再加入13.8mg亚硝酸钠,于37℃下诱变处理5~8min。
      (3)加入0.1mol/L NaOH中和至pH=7.0,中止亚硝酸作用。

三、突变型的筛选与检出

1.青霉素法淘汰野生型

(1)吸取5ml处理菌液于灭菌离心管中,3500rpm离心10min。
      (2)弃上清液,加入生理盐水,打匀沉淀,离心洗涤三次,加生理盐水至原体积。
      (3)吸取菌液0.1ml于5ml无N基本培养液中,37℃培养12h。
      (4)加入等体积2N基本培养液,加入青霉素钠盐使最终浓度约为1,000单位/ml,置37℃恒温箱中培养。
      (5)培养12、16、22h时各别取菌液0.1ml,倒入两个灭菌的培养皿中,再分别倒入经融化并冷却至40℃~50℃的基本及完全培养基中,摇匀放平,待凝固后,置37℃恒温箱中培养(在培养皿上注明取样时间)。

2.逐个测定法检出营养缺陷型

(1)以上平板培养36~48h后,进行菌落计数。选用完全培养基上长出的菌落数大大超过基本培养基的那一组,用接种针挑取完全培养基上长出的菌落80个,分别点种于基本培养基与完全培养基平板上,先点种基本培养基,后点种完全培养基,置于37℃恒温箱中培养。
      (2)培养12h后,选在基本培养基上不生长,而在完全培养基上生长的菌落,再在基本培养基的平板上划线,置于37℃恒温箱培养。24h后不生长的可能是营养缺陷型。

四、生长谱鉴定

1.突变菌株的培养与收集

(1)将可能是缺陷型的菌落接种于盛有5ml肉汤培养液的离心管中,37℃培养14-16h。
      (2)培养后,3500rpm离心10min,倒去上清液,加生理盐水,打匀沉淀,然后离心洗涤3次,最后加生理盐水到原体积。

2.营养缺陷型的鉴定

(1)吸取经离心洗涤的菌液1ml注入一灭菌的培养皿中,然后倒入融化冷却至40℃~50℃的基本培养基中,摇匀放平,待凝固,共做两只培养皿。
      (2)将2只培养皿底等分8格并标记(如右图),依次放 入混合氨基酸(包括核苷酸)、混合维生素和脯氨酸(加量要很少,否则会抑制菌的生长),然后置于37℃恒温箱培养24~48h,观察生长圈,当某一格内出现圆形混浊的生长圈时,即说明是某一氨基酸、维生素或核苷酸的缺陷型。

注意事项

皮肤曝露在紫外线下可致皮肤癌;眼睛最易受到紫外线损伤,导致短期甚至永久失明。因此,操作时要有相应的防护措施。亚硝酸也是较强致癌物质,请注意安全与环境保护。各种器具、培养基及直接加入培养基中的试剂均需灭菌。

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