房间空气从前面的开口处以0.38m/s的低速率进入安全柜，空气经过工作台表面并经排风管排出安全柜。定向流动的空气可以将工作台面上可能形成的气溶胶迅速带离实验室而被送人排风管内。操作者的双臂可以从前面的开口伸到安全柜内的工作台面上，并可以通过玻璃窗观察工作台面的情况。安全柜的玻璃窗可以完全抬起，以便清洁工作台面或进行其他处理。

安全柜内的空气通过HEPA过滤器按下列方式排出：

①排到实验室中；

②排到实验室中，然后再通过实验室排风系统排到建筑物外面；

③直接排到建筑物外面。HEPA过滤器可以装在生物安全柜的压力排风系统（the exhaust plenum）里，也可以装在建筑物的排风系统里。

有些Ⅰ级生物安全柜装配有一体式排风扇，而其他的则是借助建筑物排风系统的排风扇。

鉴于以上工作原理，Ⅰ级生物安全柜能够为操作者和环境提供保护，但未除菌的房间空气通过生物安全柜正面的开口处直接吹到工作台面上，因此它不能对被操作对象提供切实可靠的保护。I级生物安全柜除用于感染性实验操作外，也可用于操作放射性核素和挥发性有毒化学晶。