伴随电子从底物到氧的传递，ADP被磷酸化形成ATP的酶促过程即是氧化磷酸化作用。
根据生物氧化方式，可将氧化磷酸化分为：底物水平磷酸化和电子传递体系磷酸化。
底物水平磷酸化：
ATP的形成直接由一个代谢中间产物（如磷酸烯醇式丙酮酸）上的磷酸基团转移到ADP分子上的作用。
电子传递体系磷酸化：
是指当电子从NADH或FADH2经过电子传递体系(呼吸链)传递给氧形成水时，同时伴有ADP磷酸化为ATP的全过程。通常所说的氧化磷酸化是指电子传递体系磷酸化。
(1)ATP产生的数量
研究氧化磷酸化最常用的方法是测定线粒体或其制剂的P/O比值和电化学实验。
P/O比值:是指每消耗一摩尔氧所消耗无机磷酸的摩尔数。根据所消耗的无机磷酸摩尔数，可间接测出ATP生成量。又可以看作是当一对电子通过呼吸链传至O2所产生的ATP分子数。
实验表明：NADH呼吸链的P/O值是3，即每消耗一摩尔氧原子就可形成3摩尔ATP，FADH2呼吸链的P/O值是2，即消耗一摩尔氧原子可形成2摩尔ATP。
(2)ATP产生的部位
ATP产生的部位都是有大的电位差变化的地方，例如，NADH呼吸链生成ATP的三个部位是：E0'值在此三个部位有大的“跳动”，都在0.2伏以上。
(3) 能量偶联假说
氧化与磷酸化作用如何偶联尚不够清楚，目前主要有三个学说：化学耦联学说；结构耦联学说；化学渗透学说
1）.化学偶联假说（1953）
认为电子传递过程产生一种活泼的高能共价中间物。它随后的裂解驱动氧化磷酸化作用。
2）.构象偶联假说（1964）
认为电子沿电子传递传递使线粒体内膜蛋白质组分发生了构象变化，形成一种高能形式。这种高能形式通过ATP的合成而恢复其原来的构象。
3）.化学渗透学说（1961）
认为电子传递释放出的自由能和ATP合成是与一种跨线粒体的质子梯度相偶联的。
呼吸链存在于线粒体内膜之上，当氧化进行时，呼吸链起质子泵作用，质子被泵出线粒体内膜之外侧，造成了膜内外两侧间跨膜的化学电位差，后者被膜上ATP合成酶所利用，使ADP与Pi合成ATP。
电子传递使复合体Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ推动H+跨过线粒体内膜到线粒体的间隙，线粒体间隙与细胞溶胶相接触。 H+跨膜流动的结果造成线粒体内膜内部基质的H+离子浓度低于间隙。线粒体基质形成负电势，而间隙形成正电势，这样产生的电化学梯度即电动势称为质子动势或质子动力势。其中蕴藏着自由能即是ATP合成的动力。
质子转移的机制有两种假设：氧化—还原回路机制；质子泵机制
ATP的合成 是由一个酶的复合体系完成的。这个复合体系称为ATP合酶由两个主要的单元构成。起质子通道作用的单元称为Fo单元和催化ATP合成的单元称为F1单元。因此，ATP合酶又称为Fo F1—ATP酶
ATP合酶
在分离得到四种呼吸链复合体的同时还可得到复合体Ⅴ，即ATP合酶。该酶主要由Fo（疏水部分 ）和F1（亲水部分）组成。 F1在线粒体内膜的基质侧形成颗粒状突起。它主要由α3 β3 γδε亚基组成，其功能是催化生成ATP;催化部位 在β亚基中，但β亚基必须与α亚基结合才有活性。 Fo镶嵌在线粒体内膜中。它由a1b2c9-12亚基组成。C亚基形成环状结构，a亚基位于环外侧，与c亚基之间形成质子通道。 Fo与F1之间，其中心部位由γε亚基相连，外侧由b2和δ亚基相连， F1中的α3 β3 亚基间隔排列形成六聚体，部分γ亚基插入六聚体中央。
不同的化学因素对氧化磷酸化过程的影响不同，根据它们不同的影响方式可分为三大类：
1.解偶联剂：
使电子传递与ADP磷酸化两个过程分开，失掉它们的紧密联系。它只抑制ATP的形成，不抑制电子传递过程 ，使电子传递产生的自由能都变成热能。
因为这种试剂使电子传递失去正常的控制，亦即不能形成离子梯度。造成过分地利用氧和燃料底物而能量得不到贮存。
解偶联剂的作用只抑制氧化磷酸化的ATP形成，对底物水平的磷酸化没有影响。
2.氧化磷酸化抑制剂
抑制氧的利用和ATP形成，不直接稀缺电子传递。氧化磷酸化抑制剂的作用是直接干扰ATP的生成过程，结果也使电子传递不能进行。
例：寡霉素：与Fo的一个亚基结合而抑制合抑制F1
DNP(解偶联剂）可解除它对氧的抑制作用。
3.离子载体抑制剂
生物膜上的脂溶性物质，与某些离子结合，并作为它们的载体，使这些离子能够穿过膜，破坏跨膜电化学梯度，从而破坏氧化磷酸化过程。
与解偶联剂区别：H+离子以外的其它一价阳离子的载体，改变除H+以外的一价阳离子透性。
如 缬氨霉素 -> K+
短感菌肽 -> Na+ K+
线粒体外膜通透性高，线粒体对物质通过的选择性主要依赖于内膜中不同转运蛋白对各种物质的转运。
NADH脱氢酶位于线粒体内膜的内侧，只作用于线粒体内部（衬质）的NADH,而胞液中的NADH又不能直接穿赤线粒体内膜进入内部，这就需要通过一种间接途径——穿梭系统。不同真核生物细胞的胞液NADH进入线粒体呼吸链的途径有所不同：3-磷酸甘油穿梭系统,苹果酸-天冬氨酸穿梭系统
生物细胞通过氧化磷酸化和底物水平磷酸化生成ATP，在需要能量的生化反应或生命活动中又分解ATP,使ATP转化为ADP和Pi，或转化为AMP和Pi。这样在细胞内存在着三种腺苷酸： ATP、 ADP和AMP，称为腺苷酸库。
能荷：是细胞中高能磷酸状态一种数量上的衡量，也就是指细胞内ATP— ADP—AMP系统中充满高能磷酸基团的程度。
能荷是细胞所处能量状态的一个指标，当细胞内的ATP全部转变为AMP时能荷值为0，当AMP全部转变为ATP时，能荷值为1。
高能荷抑制ATP的生成，促进ATP的应用，即促进机体内的合成代谢。大多数细胞的能荷处于0.8-0.95之间。进一步说明细胞内ATP的产生和利用都处于一个相对稳定的状态.能荷的调节是靠ATP、ADP、AMP对代谢中酶的变构调节实现的。
