问:我是做脂肪酶克隆表达的。现在已经将目的基因整合到毕赤酵母GS115中,可是几番诱导下来,就是没有酶活。现在小弟想请教各位战友几个脂肪酶活性检测的问题,怕是表达出来,因为检测方法有误。 1、诱导培养基BMMY的磷酸缓冲液浓度为100mmol/L,请问这个浓度是不是太高?如果脂肪酶表达量很低的话,测定过程中产生的游离脂肪酸也很少。如果活性测定的磷酸缓冲液浓度太高的话,会不会影响测定结果,也就是说将酶活掩盖? 2、在测完酶活后,发现三角烧瓶壁上粘附着一些乳化油。需要用很浓的氢氧化钠才能清洗掉。请问这是不是说明我的乳化工作做的不好。可是我的乳化液配好了放在冰箱4度保存刚一个周啊? 3、菌液在离心时,我是用5000(4度)离心10分钟的。如果有表达的话,这个转速不应该把蛋白离下去吧? 我的脂肪酸测定流程: 请各位战友看看这个流程有没有问题,谢谢! 答:乳化液要现配的,PVA与橄榄油比为2:1 ,还有你的缓冲液的PH值,50度是不是太高了点,有没有用破乳剂呀? 答:我们这也是做脂肪酶的,我们做过乳化液要现配。破乳剂就是用10ML30%的氯化钠,你可以试试。还有就是反应的最适PH,你也可以做几个不同的温度、PH看看。 |
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