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电泳技术

标签: 电泳 梯度凝胶电泳 SDS 丙烯酰胺

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电泳技术发展简史编辑本段回目录

1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极,加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊,即带负电荷的粘土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。
1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。
1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进,创造了Tiselius电泳仪,建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法,并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的,由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。
1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法,对氨基酸的分离进行过研究。
从本世纪50年代起,特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后,开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。
1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质,创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,极大地提高了电泳技术的分辨率,开创了近代电泳的新时代。30多年来,聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍,分辨率最高的分析鉴定技术,是检验生化物质的最高纯度:即“电泳纯”(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法,至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段,即“Last Check”。
由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术,是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展,己受到人们的充分重视。
 
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电泳的基本原理编辑本段回目录

电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质,所以扩散和对流都比较强,影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳,样品在固定的介质中进行电泳过程,减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜,目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里,小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析,但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质,操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展,使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶,但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
电泳装置主要包括两个部分:电源和电泳槽。电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种,常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板,玻璃板两边由塑料条隔开,在玻璃平板中间制备电泳凝胶,凝胶的大小通常是12cm ´ 14 cm,厚度为1mm~2 mm,近年来新研制的电泳槽,胶面更小、更薄,以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子,在胶聚合后移去,形成上样品的凹槽。水平式电泳,凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上,用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液,或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变,进而影响其电泳迁移的速度,所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的,缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。
为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的,下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压(V),就会在电极中间产生电场强度(E),
    上式中L是电极间距离。
在稀溶液中,电场对带电分子的作用力(F),等于所带净电荷与电场强度的乘积:
      
上式中q是带电分子的净电荷,E是电场强度。
这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中,分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力(F’)的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关,并与带电分子的移动速度成正比,对于球状分子,F’的大小服从Stokes定律,即:
                                  F’=6πrηυ
式中r是球状分子的半径,η是缓冲液粘度,υ是电泳速度(υ= d / t,单位时间粒子运动的距离,cm / s )。当带电分子匀速移动时:  F = F’,
                             ∴   q•E = 6πrηυ
 
电泳迁移率(m)是指在单位电场强度(1V/cm)时带电分子的迁移速度:                          
所以:                                                     
这就是迁移率公式,由上式可以看出,迁移率与带电分子所带净电荷成正比,与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时,实际使用的是相对迁移率mR。即:
上式中:d-带电粒子泳动的距离,t-电泳的时间,V-电压,L-两电极交界面之间的距离,即凝胶的有效长度。 因此,相对迁移率mR就是两种带电粒子在凝胶中泳动迁移的距离之比。          
    带电分子由于各自的电荷和形状大小不同,因而在电泳过程中具有不同的迁移速度,形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷,如果它们的分子大小不同,由于它们所受的阻力不同,因此迁移速度也不同,在电泳过程中就可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离,如等电聚焦电泳;而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离,如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的样品通过各种方法的染色,或者如果样品有放射性标记,则可以通过放射性自显影等方法进行检测。
 
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影响电泳分离的主要因素编辑本段回目录

由电泳迁移率的公式可以看出,影响电泳分离的因素很多,下面简单讨论一些主要的影响因素:
1. 待分离生物大分子的性质
待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说,分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形,则其电泳迁移速度越快。
2. 缓冲液的性质
缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度,从而对其带电性质产生影响,溶液pH值距离其等电点愈远,其所带净电荷量就越大,电泳的速度也就越大,尤其对于蛋白质等两性分子,缓冲液pH还会影响到其电泳方向,当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点,蛋白质分子带负电荷,其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性,缓冲液通常要保持一定的离子强度,一般在0.02-0.2,离子强度过低,则缓冲能力差,但如果离子强度过高,会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层(即离子氛),由于离子氛与待分离分子的移动方向相反,它们之间产生了静电引力,因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。
3. 电场强度
电场强度(V/cm)是每厘米的电位降,也称电位梯度。电场强度越大,电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大,而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功(W)为:
                           W=I2.R.t
上式中:I为电流强度,R为电阻,t为电泳时间。
电流所作的功绝大部分都转换为热,因而引起介质温度升高,这会造成很多影响:
①样品和缓冲离子扩散速度增加,引起样品分离带的加宽;②产生对流,引起待分离物的混合;③如果样品对热敏感,会引起蛋白变性;④引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的,所以介质中心温度一般要高于外周,尤其是管状电泳,由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降,摩擦系数减小,电泳迁移速度增大,由于中央部分的电泳速度比边缘快,所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度,可以减小生热,但会延长电泳时间,引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度,同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。
4. 电渗
液体在电场中,对于固体支持介质的相对移动,称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团,如滤纸表面通常有一些羧基,琼脂可能会含有一些硫酸基,而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电,吸附一些带相反电荷的离子,在电场的作用下向电极方向移动,形成介质表面溶液的流动,这种现象就是电渗。在pH值高于3时,玻璃表面带负电,吸附溶液中的正电离子,引起玻璃表面附近溶液层带正电,在电场的作用下,向负极迁移,带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同,则加快电泳速度;如果相反,则降低电泳速度。
5. 支持介质的筛孔
支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快,反之,则泳动速度慢。
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电泳的分类编辑本段回目录

    电泳按其分离的原理不同可分为:
  ⑴ 区带电泳:电泳过程中,待分离的各组分分子在支持介质中被分离成许多条明显的区带,这是当前应用最为广泛的电泳技术。
  ⑵ 自由界面电泳: 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术,是在U形管中进行电泳,无支持介质,因而分离效果差,现已被其他电泳技术所取代。
  ⑶ 等速电泳:需使用专用电泳仪,当电泳达到平衡后,各电泳区带相随,分成清晰的界面,并以等速向前运动。
  ⑷ 等电聚焦电泳:由两性电解质在电场中自动形成pH梯度,当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。
    按支持介质的不同可分为:
  ⑴ 纸电泳(Paper electrophorisis)
  ⑵ 醋酸纤维薄膜电泳(Cellulose Acetate electrophoresis)
  ⑶ 琼脂凝胶电泳(Agar Gel electrophoresis)
  ⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis)(PAGE)
  ⑸ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
    按支持介质形状不同可它为:
  ⑴ 薄层电泳 ;     ⑵ 板电泳 ;      ⑶ 柱电泳。
    按用途不同可分为:
  ⑴ 分析电泳;   ⑵ 制备电泳;   ⑶ 定量免疫电泳;  ⑷ 连续制备电泳。
    按所用电压不同可分为:
  ⑴ 低压电泳:100V~500V,电泳时间较长,适于分离蛋白质等生物大分子。
  ⑵ 高压电泳:1000V~5000V,电泳时间短,有时只需几分钟,多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。

电泳分析常用方法编辑本段回目录

  (一)醋酸纤维素薄膜电泳
  醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小,几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象,又因为膜的亲水性比较小,它所容纳的缓冲液也少,电泳时电流的大部分由样品传导,所以分离速度快,电泳时间短,样品用量少,5μg的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。
  醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存。
  ⒈材料与试剂  醋酸纤维素膜一般使用市售商品,常用的电泳缓冲液为pH8.6的巴比妥缓冲液,浓度在0.05-0.09mol/L。
  ⒉操作要点
  ⑴膜的预处理:必须于电泳前将膜片浸泡于缓冲液,浸透后,取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液,不可吸得过干。
  ⑵加样:样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋白质的常规电泳分析,每cm加样线不超过1μl,相当于60-80μg的蛋白质。
  ⑶电泳:可在室温下进行。电压为25V/cm,电流为0.4-0.6mA/cm宽。
  ⑷染色:一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红,糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂,脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。
⑸脱色与透明:对水溶性染料最普遍应用的脱色剂是5%醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收扫描测定,可浸入冰醋酸:无水乙醇=30:70(V/V)的透明液中。

  (二)凝胶电泳
  以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大,对一般蛋白质不起分子筛作用,但适用于分离同工酶及其亚型,大分子核酸等应用较广,介绍如下:
  ⒈琼脂糖凝胶电泳的原理概述  琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的检测。
  ⒉琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术  在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中,DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比;分子构型也对迁移率有影响,如共价闭环DNA>直线DNA>开环双链DNA。当凝胶浓度太高时,凝胶孔径变小,环状DNA(球形)不能进入胶中,相对迁移率为0,而同等大小的直线DNA(刚性棒状)可以按长轴方向前移,相对迁移率大于0。
  ⑴设备与试剂:琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶,而且制胶与加样都比较方便,故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系,常用的有TBE(0.08mol/L Tris•HCl,pH8.5,0.08mol/L硼酸,0.0024mol/L EDTA)和THE(0.04mol/L Tris•HCl。pH7.8,0.2mol/L醋酸钠,0.0018mol/L EDTA)。
  ⑵凝胶制备:用上述缓冲液配制0.5%-0.8%琼脂糖凝胶溶液,沸水浴或微波炉加热使之融化,冷至55℃时加入溴化乙锭(EB)至终浓度为0.5μg/ml,然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中,厚度依样品浓度而定。注胶时,梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm,待脱凝固后,取出梳子,加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。
  ⑶样品制备与加样:溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料(0.025%溴酚蓝或桔黄橙)、蔗糖(10%-15%)或甘油(5%-10%),也可使用2.5%Fico Ⅱ增加比重,使样品集中,每齿孔可加样5-10μg。
  ⑷电泳:一般电压为5-15V/cm。对大分子的分离可用电压5V/cm。电泳过程最好在低温条件下进行。
  ⑸样品回收:电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况,对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收,如电泳洗脱法:在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶,将其装入透析袋(内含适量新鲜电泳缓冲液),扎紧透析袋后,平放在水平型电泳槽两电极之间的浅层缓冲液中,100V电泳2-3小时,然后正负电极交换,反向电泳2分钟,使透析袋上的DNA释放出来。吸出含DNA的溶液,进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收。
其它还有低融点琼脂糖法、醋酸铵溶液浸出法、冷冻挤压法等,但各种方法都仅仅有利于小分子量DNA片段(<1kb=的回收,随着DNA分子量的增大,回收量显著下降。

  (三)等电聚焦电泳技术
  等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位,因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。
  ⒈IEF的基本原理  在IEF的电泳中,具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极,pH值逐渐增大。如前所述,蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征,这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动,直至某一pH位点时失去电荷而停止移动,此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点(pl)。同理,位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动,直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中,等电点是蛋白质组分的特性量度,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中,在电场内经过一定时间后,各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上,形成分离的蛋白质区带。
  ⒉pH梯度的组成  pH梯度的组成方式有二种,一种是人工pH梯度,由于其不稳定,重复性差,现已不再使用。另一种是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物,在正极端吸入酸液,如硫酸、磷酸或醋酸等,在负极端引入碱液,如氢氧化钠、氨水等。电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值,即各段介质中的pH相等,用pH0表示。电泳开始后,混合物中pH最低的分子,带负电荷最多,pI1为其等电点,向正极移动速度最快,当移动到正极附近的酸液界面时,pH突然下降,甚至接近或稍低于PI1,这一分子不再向前移动而停留在此区域内。由于两性电解质具有一定的缓冲能力,使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。pH稍高的第二种两性电解质,其等电点为pI2,也移向正极,由于pI2>pI1,因此定位于第一种两性电解质之后,这样,经过一定时间后,具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列,形成了从正极到负极等电点递增,由低到高的线性pH梯度,如图16-3所示。
  ⒊两性电解质载体与支持介质  理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导,前者保证pH梯度的稳定,后者允许一定的电流通过。不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀。两性电解质的分子量要小,易于应用分子筛或透析方法将其与被分离的高分子物质分开,而且不应与被分离物质发生反应或使之变性。
  常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等,其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。
电泳后,不可用染色剂直接染色,因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合,因此应先将凝胶浸泡在5%的三氯醋酸中去除两性电解质,然后再以适当的方法染色。

  (四)其他电泳技术
  ⒈IEF/SDS-PAGE双向电泳法  1975年O′Farrall等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立了IEF/SD S-PAGE双向电泳。其中IEF电泳(管柱状)为第一向,SDS-PAGE为第二向(平板)。在进行第一向IEF电泳时,电泳体系中应加入高浓度尿素、适量非离子型去污剂NP-40。蛋白质样品中除含有这两种物质外还应有二硫苏糖醇以促使蛋白质变性和肽链舒展。
  IEF电泳结束后,将圆柱形凝胶在SDS-PAGE所应用的样品处理液(内含SDS、β-巯基乙醇)中振荡平衡,然后包埋在SDS-PAGE的凝胶板上端,即可进行第二向电泳。
  IEF/ SDS-PAGE双向电泳对蛋白质(包括核糖体蛋白、组蛋白等)的分离是极为精细的,因此特别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。
  ⒉毛细管电泳  Neuhoff等人于1973年建立了毛细管均一浓度和梯度浓度凝胶用来分析微量蛋白质的方法,即微柱胶电泳,均一浓度的凝胶是将毛细管浸入凝胶混合液中,使凝胶充满总体积的2/3左右,然后将其揿入约厚2mm的代用粘土垫上,封闭管底,用一支直径比盛凝胶的毛细管更细的硬质玻璃毛细管吸水铺在凝胶上。聚合后,除去水层并用毛细管加蛋白质溶液(0.1-1.0μl,浓度为1-3mg/ml)于凝胶上,毛细管的空隙用电极缓冲液注满,切除插入粘土部分,即可电泳。
  目前毛细管电泳分析仪的诞生,特别是美国生物系统公司的高效电泳色谱仪为DNA片段、蛋白质及多肽等生物大分子的分离、回收提供了快速、有效的途径。高效电泳色谱法是将凝胶电泳解析度和快速液相色谱技术溶为一体,在从凝胶中洗脱样品时,连续的洗脱液流载着分离好的成分,通过一个连机检测器,将结果显示并打印记录。高效电泳色谱法既具有凝胶电泳固有的高分辨率,生物相容性的优点,又可方便地连续洗脱样品。

纸电泳法编辑本段回目录

纸电泳是用滤纸作支持介质的一种早期电泳技术。尽管分辨率比凝胶介质要差,但由于其操作简单,所以仍有很多应用,特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途。
纸电泳使用水平电泳槽。分离氨基酸和核苷酸时常用pH 2~3.5的酸性缓冲液,分离蛋白质时常用碱性缓冲液。选用的滤纸必须厚度均匀,常用国产新华滤纸和进口的Whatman 1号滤纸。点样位置是在滤纸的一端距纸边5cm~10cm处。样品可点成园形或长条形,长条形的分离效果较好。点样量为5mg~100mg和5ml~10ml。点样方法有干点法和湿点法。湿点法是在点样前即将滤纸用缓冲液浸湿,样品液要求较浓,不亦多次点样。干点法是在点样后再用缓冲液和喷雾器将滤纸喷湿,点样时可用吹风机吹干后多次点样,因而可以用较稀的样品。电泳时要选择好正、负极,电压通常使用2~10 V/cm的低压电泳,电泳时间较长。对于氨基酸和肽类等小分子物质,则要使用50~200 V/cm的高压电泳,电泳时间可以大大缩短,但必须解决电泳时的冷却问题,并要注意安全。
电泳完毕记下滤纸的有效使用长度,然后烘干,用显色剂显色,显色剂和显色方法,可查阅有关书藉。定量测定的方法有洗脱法和光密度法。洗脱法是将确定的样品区带剪下,用适当的洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的含量。
实验方法

1.仪器装置 包括电泳室及直流电源两部分。 常用的水平式电泳室装置如图,包括两个电泳槽A和一个可以密封的玻璃(或相应材料)盖B;两侧的电泳槽均用有机玻璃(或相应材料)板C分成两部分;外格装有铂电极(直径0.5~0.8cm)D;里格为可放滤纸E的有机玻璃电泳槽架F,此架可从槽中取出;两侧电泳槽A内的铂电极D经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连。 电源为具有稳压器的直流电源,常压电泳一般在100~500V,高压电泳一般在500~10 000V。
2. 操作法 (1) 电泳缓冲液 枸橼酸盐缓冲液(pH3.0) 取枸橼酸 (C6H8O7•H2O)39.04g与枸橼酸钠(C6H5Na3O7•2H2O)4.12g,加水4000ml,使溶解。 (2) 滤纸 取色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜,次日取出,用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干,备用。可按需要裁成长27cm、宽18cm的滤纸,或根据电泳室的大小裁剪,并在距长度方向一端5~8cm处划一起始线,每隔2.5~3cm处做一记号备点样用。  (3) 点样 有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)中,湿润后,取出,用滤纸吸干多余的缓冲液,置电泳槽架上,使起始线靠近阴极端,将滤纸两端浸入缓冲液中,然后用微量注射器精密点加供试品溶液,每点10μl,共3点,并留2个空白位置。 干点法是将供试品溶液点于滤纸上,吹干、再点,反复数次,直至点完规定量的供试品溶液,然后用喷雾器将滤纸喷湿,点样处最后喷湿,本法适用于稀的供试品溶液。 (4) 电泳 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没铂电极,接通电泳仪稳压电源挡,调整电压梯度为18~20V/cm,电泳约1小时45分钟,取出,立即吹干,置紫外光灯(254nm)下检视,用铅笔划出紫色斑点的位置。 (5) 含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸,剪成细条,分别置试管中,各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml,摇匀,放置1小时,用3号垂熔玻璃漏斗滤过,也可用自然沉降或离心法倾取上清液,按各药品项下的规定测定吸收度,并按吸收系数计算含量。

醋酸纤维素薄膜电泳法编辑本段回目录

    醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相似,只是换用了醋酸纤维薄膜作为支持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯,溶于丙酮后涂布成有均一细密微孔的薄膜,其厚度为0.1~0.15mm。
    醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相比有以下优点:① 醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少,无“拖尾”现象,染色后蛋白质区带更清晰。② 快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性比滤纸小,吸水少,电渗作用小,电泳时大部分电流由样品传导,所以分离速度快,电泳时间短,完成全部电泳操作只需90 min左右。③ 灵敏度高,样品用量少。血清蛋白电泳仅需 2ml 血清,点样量甚至少到0. 1ml,仅含5mg的蛋白样品也可以得到清晰的电泳区带。临床医学用于检测微量异常蛋白的改变。④ 应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品,如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等。⑤ 醋酸纤维薄膜电泳染色后,用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板,有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。
    由于醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、价廉,目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子,为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据,因而已成为医学和临床检验的常规技术。
实验方法

1.仪器装置 电泳室及直流电源同纸电泳。
2.试剂 (1) 巴比妥缓冲液(pH8.6)取巴比妥2.76g,巴比妥钠15.45g,加水溶解使成1000ml。 (2) 氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。 (3) 漂洗液 取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混匀。 (4) 透明液 取冰醋酸25ml,加无水乙醇75ml,混匀。 3.操作法 (1) 醋酸纤维素薄膜 取醋酸纤维素薄膜,裁成2cm×8cm的膜条,将无光泽面向下,浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夹于滤纸中,轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。 (2) 点样与电泳 于膜条上距负极端2cm处,条状滴加蛋白含量约5%的供试品溶液2~3μl,在10~12V/cm电位梯度下电泳。电泳区带距离以4~5cm为宜。 (3) 染色 电泳完毕,将膜条取下浸于氨基黑染色液中,2~3分钟后,用漂洗液浸洗数次,直至脱去底色为止。 (4) 透明 将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中10~15分钟,取出平铺于洁净的玻板上,干后即成透明薄膜,可于分光光度计上测定和作标本长期保存。 (5) 含量测定 未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各药品项下规定的方法测定,一般采用洗脱法或扫描法,测定各蛋白质组分的相对百分含量。 洗脱法 将洗净的膜条用滤纸吸干,剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带,分别浸于1.6%的氢氧化钠溶液中,振摇数次,至洗脱完全, 于一定波长下测定吸收度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位,同法操作作对照。先计算吸收值总和,再计算各蛋白组分所占百分率。 扫描法 将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪通过反射 (未透明薄膜) 或透射(已透明薄膜)方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图,横坐标为膜条的长度,纵坐标为吸收度,计算各蛋白组分的百分含量。亦可用微机处理积分计算。

琼脂糖凝胶电泳法编辑本段回目录

琼脂糖是从琼脂中提纯出来的,主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中,通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清,注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构,这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制,低浓度的琼脂糖形成较大的孔径,而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷,但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代,使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷,引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用,影响分离效果。市售的琼脂糖有不同的提纯等级,主要以硫酸根的含量为指标,硫酸根的含量越少,提纯等级越高。
琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质,尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的,对蛋白质的阻碍作用较小,这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小,所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术,如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析,由于DNA、RNA分子通常较大,所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用,这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA,电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关,而与碱基排列及组成无关。另外,一些低熔点的琼脂糖(62 ~ 65 °C)可以在65 °C时熔化,因此其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。
由于琼脂糖凝胶的弹性较差,难以从小管中取出,所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳,管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶,用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳,以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。

实验方法

1.仪器装置 电泳室及直流电源同纸电泳。
2.试剂 (1) 醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0) 取冰醋酸50ml,加水800ml混合后,用氢氧化锂调节pH至3.0,再加水至1000ml。 (2) 甲苯胺蓝溶液 取甲苯胺蓝0.1g,加水100ml使溶解。 3.操作法 (1)制胶 取琼脂糖约0.2g,加水10ml,置水浴中加热使溶胀完全,加温热的醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0)10ml,混匀,趁热将胶液涂布于大小适宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上,厚度约3mm,静置,待凝胶结成无气泡的均匀薄层,即得。 (2) 标准品溶液及供试品溶液的制备 照各药品项下规定配制。 (3) 点样与电泳 在电泳槽内加入醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0),将凝胶板置于电泳槽架上,经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样1μl,立即接通电源,在电压梯度约30V/cm,电流强度1~2mA/cm的条件下,电泳约20分钟,关闭电源。 (4) 染色与脱色 取下凝胶板,用甲苯胺蓝溶液染色,用水洗去多余的染色液至背景无色为止。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法编辑本段回目录

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2  N,N’-methylenebisacrylamide)聚合而成,这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种:化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵(AP)以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED),四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。由于乙烯基“CH2=CH-”一个接一个的聚合作用就形成丙烯酰胺长链,同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联,从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除作用,所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。丙烯酰胺的另一种聚合方法是光聚合,催化剂是核黄素,核黄素在光照下能够产生自由基,催化聚合反应。一般光照2-3小时即可完成聚合反应。
    聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制,丙烯酰胺的浓度可以在3%-30%之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径,如3%的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用,可用于平板等电聚焦或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶,也可以用于分离DNA;高浓度凝胶具有较小的孔径,对蛋白质有分子筛的作用,可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中,如10%-20%的凝胶常用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C,T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是:
 
    上式中a为丙烯酰胺的克数,b为甲叉双丙烯酰胺的克数,m为水或缓冲液体积(ml)。式中a与b的比例很重要。富有弹性,且完全透明的凝胶,a与b的重量比应在30左右。选择T和C的经验公式是:
                        C = 6.5-0.3T
此式可用于计算T为5%~20%时的凝胶组成。C值并不很严格,在大多数情况下,可变化的范围约为 ±1%,当C保持恒定时,凝胶的有效孔径随着T的增加而减小,当T保持恒定,C为4%时,有效孔径最小,C大于或小于4%时,有效孔径均变大,C大于5%时凝胶变脆,不宜使用,实验中最常用的C是2.6%和3%。
配成30%的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1个月,在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂,操作时要避免直接接触皮肤,但它们聚合后则无毒。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷,它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用,因而可以得到较高的分辨率,尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性,对于生物大分子的鉴定有重要意义,其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳,电泳后将凝胶切成两半,一半用于活性染色,对某个特定的生物大分子进行鉴定,另一半用于所有样品的染色,以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点,因而四十年来得到广泛的应用,目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有:①可以随意控制胶浓度“T”和交联度“C”,从而得到不同的有效孔径,用于分离不同分子量的生物大分子。②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中,达到更高的灵敏度:10-9 ~10-12 mol/L。③由于聚丙烯酰胺凝胶是由-C-C-键结合的酰胺多聚物,侧链只有不活泼的酰胺基-CO-NH2 ,没有带电的其他离子基团,化学惰性好,电泳时不会产生“电渗”。④由于可以制得高纯度的单体原料,因而电泳分离的重复性好。⑤透明度好,便于照相和复印。机械强度好,有弹性,不易碎,便于操作和保存。⑥无紫外吸收,不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。⑦还可以用作固定化酶的惰性载体。
聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的,玻璃管通常直径为7 mm,长10 cm,将凝胶装入到多个管中进行电泳,又称为柱状电泳。目前仍有应用,尤其用于二维电泳中的第一维电泳。但由于各个玻璃管的不同以及装胶时的差异使每管的分离条件会有所差异,所以对各管样品进行比较时可能会出现较大误差。后来发展起来的垂直平板电泳一次最多可以容纳20个样品,电泳过程中样品所处的条件比较一致,样品间可以进行更好的比较,重复性也更好,所以垂直平板电泳目前应用的更为广泛,常用于蛋白质及DNA序列分析过程中DNA片段的分离、鉴定。
水平平板电泳近年来也有很快的发展,与垂直平板电泳相比也有其独特的优点:①由于凝胶可以直接铺在冷却板上,容易使凝胶冷却,因而可以加高电压以提高分辨率。②电泳速度快,通常只要1小时左右,而园盘电泳和垂直平板电泳一般需要3~4小时。③因为可以使用薄胶,加样少,染色快,从而提高了灵敏度,而且容易保存,只要用甘油浸泡后自然干燥即可长期保存不会龟裂。④便于适用各种电泳方式,用途广泛,尤其是可以使用90年代才发展起来的只有水平电泳系统才能使用的新的半干技术,即用浸有少量缓冲液的半干的胶条代替通常所用的大量电极缓冲液,大大节约了试剂,简化了操作,提高了电泳速度。
实验方法

1.仪器装置 通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极,铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。
2.试剂 (1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g,四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml,再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内,在冰箱中保存。 (2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g,加水溶解并稀释至100ml,滤过,置棕色瓶内,在冰箱中保存。 (3)电极缓冲液(pH8.3) 取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml,置冰箱中保存,用前稀释10倍。 (4)溴酚蓝指示液 取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90%乙醇5ml,微热使溶解,加20%乙醇制成250ml。 (5)染色液 取0.25%(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。 (6)稀染色液 取上述染色液2ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。 (7)脱色液 7%醋酸溶液。
3.操作法 (1)制胶 取溶液A2ml,溶液B5.4ml,加尿素2.9g使溶解,再加水4ml,混匀,抽气赶去溶液中气泡, 加0.56%过硫酸铵溶液2ml,混匀制成胶液,立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6~7cm, 然后徐徐滴加水少量,使覆盖胶面,管底气泡必须赶走,静置约30分钟,待出现明显界面时即聚合完毕,吸去水层。 (2)标准品溶液及供试品溶液的制备 照各药品项下的规定。 (3)电泳 将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内,每管加供试品或标准品溶液50~100μl,为防止扩散可加甘油或40%蔗糖溶液1~2滴及0.04%溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04%溴酚蓝指示液数滴,玻璃管的上部用电极缓冲液充满,上端接负极、下端接正极。调节起始电流使每管为1mA,数分钟后,加大电流使每管为2~3mA,当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处,关闭电源。 (4)染色和脱色 电泳完毕,用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部沿胶管壁将水压入,胶条即从管内滑出,将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡10~30分钟,以水漂洗干净,再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的底色透明为止。 (5)结果判断 将胶条置灯下观察,根据供试品与标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。 相对迁移率 供试品和标准品的电泳区带有时可用相对迁移率(R'<[m]>)进行比较。
进胶端到溴酚蓝区带的距离 扫描 将清晰的胶条置双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并积分,由各组分的峰面积计算百分含量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法编辑本段回目录

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
SDS-PAGE 是在要走电泳的样品中加入含有SDS和b-巯基乙醇的样品处理液,SDS即十二烷基磺酸钠(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+),是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构,强还原剂b-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后,要在沸水浴中煮3~5 min,使SDS与蛋白质充分结合,以使蛋白质完全变性和解聚,并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料,用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。
制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度,例如通常使用的15%的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104~105,即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶,而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径,这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质,需要使用低浓度如10%或7.5%的凝胶(孔径较大);而对于分离较小的蛋白质,使用的较高浓度凝胶(孔径较小)可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后,通常在上面加上一层浓缩胶(约1 cm),并在浓缩上插入样品梳,形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶,由于浓缩胶具有较大的孔径(丙烯酰胺浓度通常为3~5%),各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常pH值较低(通常pH = 6.8),用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳,上样后即可通电开始电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统,即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统,不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统,其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4%,pH = 6.8,分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5%,pH = 8.8。电极缓冲液的pH = 8.3,用Tris、SDS和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用Tris、SDS和HCl配制。
样品在电泳过程中首先通过浓缩胶,在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子,Cl-、甘氨酸阴离子以及蛋白质-SDS复合物,在浓缩胶的pH值下,甘氨酸只有少量的电离,所以其电泳迁移率最小,而Cl-的电泳迁移率最大。在电场的作用下,Cl-最初的迁移速度最快,这样在Cl-后面形成低离子浓度区域,即低电导区,而低电导区会产生较高的电场强度,因此Cl-后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后,Cl-和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质-SDS复合物由于相对量较少,聚集在甘氨酸和Cl-的界面附近而被浓缩成很窄的区带(可以被浓缩三百倍),所以在浓缩胶中Cl-是快离子(前导离子),甘氨酸是慢离子(尾随离子)。
当甘氨酸到达分离胶后,由于分离胶的pH值(通常pH = 8.8)较大,甘氨酸离解度加大,电泳迁移速度变大超过蛋白质-SDS复合物,甘氨酸和Cl-的界面很快超过蛋白质-SDS复合物。这时蛋白质-SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳,向正极移动。由于蛋白质-SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷,所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶,进入分离胶后,由于聚丙烯酰胺的分子筛作用,小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径,阻力小,迁移速度快;大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后,这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置。当指示剂到达凝胶底部时,停止电泳,从平板中取出凝胶。在适当的染色液中(如通常使用的考马斯亮蓝)染色几个小时,而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料,这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要1~1.5小时,电泳在25~30mA下通常需要3小时,染色2~3小时,过夜脱色。通常使用的垂直平板电泳可以同时进行多个样品的电泳。
Ornstein和Davis设计的高pH碱性不连续系统,有其独特的特点。根据Henderson-Hasselbalch公式:
式中的“α”是缓冲液中各种分子的离解度。由上式可以看出:① 浓缩胶的pH(6.8)小于慢离子甘氨酸的pKa(9.8)3个pH左右,所以 α≈ 0.001,即在浓缩胶中甘氨酸只有0.1%离解,因此在电场中迁移很慢,是慢离子。② 快离子Cl-由于几乎全部离解,电泳迁移率最大,不受pH变化的影响。③ 分离胶的pH(8.8)小于慢离子的pKa 一个pH左右,α≈ 0.1,所以在分离胶中甘氨酸离解加大,电泳迁移率加大,就赶到蛋白质带的前面。
此外还可以总结出该系统的特点有:④ 电极缓冲液中共轭碱Tris的pKa小于分离胶的pH约1个pH,使其缓冲能力大。⑤电极缓冲液的pH为8.3,相近于Tris的pKa(8.1),以便获得最大的缓冲能力。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定,在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳,测定各个的标准蛋白的电泳距离(或迁移率),并对各自分子量的对数(log Mr)作图,即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离(或迁移率),通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测,纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带,但如果蛋白质是由不同的亚基组成的,它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度,一般只需要不到微克量级的蛋白质,而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况,这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。
简而言之,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量,是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷,消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白分子相对迁移率(R'<[m]>)的大小完全取决于分子量的高低,因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。
1.仪器装置 除另有规定外,同聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2.试剂 (1)丙烯酰胺液溶 称取丙烯酰胺22.2g与双丙烯酰胺0.6g, 溶于100ml水中,贮于褐色瓶中低温保存。 (2) 凝胶缓冲液 称取磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O)8.82g 、磷酸氢二钠(Na2HPO4 •12H2O)51.55g与十二烷基硫酸钠2.0g,加水至1000ml(若有沉淀析出,可加温至37℃溶解)。 (3)电泳缓冲液 将凝胶缓冲液稀释1倍。 (4)染色液 称取25mg考马斯亮蓝R<[250]>,溶于57%乙醇与9.2%醋酸混合液100ml中。 (5)脱色液 取无水乙醇75ml,加冰醋酸50ml,用水稀释至1000ml。
3.操作法 除下列规定外,其他均同聚丙烯酰胺凝胶电泳。 (1)制胶 用丙烯酰胺溶液-凝胶缓冲液-水-1.6%过硫酸铵溶液-四甲基乙二胺(需冷却)(10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045) 配制而成。 (2)标准蛋白溶液及供试品溶液的制备 取标准蛋白,加水制成每1ml中含2~5mg的溶液,与水解液(取尿素21.6g和十二烷基硫酸钠0.04g,溶于40ml水中)1∶3混合,置冰箱中过夜。供试品照上述方法配制。 (3)电泳 调节电流使每管为8mA。
4.相对迁移率和分子量计算 将电泳脱色后的区带用卡尺或用扫描定位法测量染料移动的距离、染色前胶条长度、蛋白移动距离和脱色后的胶条长度。按下式计算相对迁移率: 蛋白移动的距离 染色前的胶条长度 相对迁移率(R'<[m]>)=───×─── 脱色后的胶条长度 染料移动的前沿距离 以R'<[m]>为横坐标,已知分子量标准蛋白的对数为纵坐标,在半对数坐标纸上绘图,由标准曲线中查出供试品分子量。

梯度凝胶电泳编辑本段回目录

梯度凝胶电泳也通常采用聚丙烯酰胺凝胶,但不是在单一浓度(孔径)的凝胶上进行,而是形成梯度凝胶。从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化,如通常顶部凝胶浓度为5%,底部凝胶浓度为25%。凝胶梯度是通过梯度混合器形成的,高浓度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中,而后溶液浓度呈梯度下降,因此在凝胶的顶部孔径较大,而在凝胶的底部孔径较小。梯度凝胶电泳也通常加入SDS,并有浓缩胶。电泳过程与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳基本类似。与单一浓度的凝胶相比,梯度凝胶有几个优点:①首先,梯度凝胶比单一浓度凝胶的分离范围更宽,可以同时分离较大范围分子量的蛋白质。单一凝胶电泳对于分子量超过其分离范围的蛋白质,过大或过小,都不能分离。而梯度凝胶孔径范围比单一凝胶大,分子量较大的蛋白质可以在凝胶顶部大孔径部分得到分离,而分子量较小的蛋白质可以在凝胶底部小孔径部分得到分离,所以分子量较大和较小的蛋白质可以同时得到分离。例如用4%~30%的梯度胶可以分离分子量5万~200万的蛋白质。② 另一个优点是梯度凝胶可以分辨分子量相差较小,在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。电泳过程中,蛋白质在梯度凝胶中迁移,经过的孔径越来越小,直到凝胶的孔径不能通透,这样电泳过程中蛋白质就被浓缩,集中在一个很窄的区带中。而分子量略小的蛋白质可以迁移得更靠前一些,被集中在略前面的区带中。由于梯度凝胶孔径逐步变小,在蛋白质不能通透的孔径附近对蛋白有浓缩作用,所以电泳后形成很窄的区带,可以分辨出分子量相差较小的蛋白质。对于太稀的样品,在电泳过程中可以将样品分几次加样,大小不同的蛋白质分子最终都会滞留在其相应的凝胶孔径中而得到分离。③ 可以直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解离为亚基,因此这一方法可以与SDS-PAGE测定分子量的方法互为补充。
梯度凝胶电泳主要适用于测定球蛋白的分子量,而对纤维蛋白将产生较大的误差。由于分子量的测定必须是在未知和标准蛋白质分子到达完全被阻止迁移的孔径时才能成立,因此电泳时要使用较高的电压,例如平板凝胶为0.5mm厚,使用600V电压, 50mA电流,电泳时间约需2小时。

等电聚焦电泳编辑本段回目录

等电聚焦电泳是根据两性物质等电点(pI)的不同而进行分离的,它具有很高的分辨率,可以分辨出等电点相差0.01的蛋白质,是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。等电聚焦的分离原理是在凝胶中通过加入两性电解质形成一个pH梯度,两性物质在电泳过程中会被集中在与其等电点相等的pH区域内,从而得到分离。
两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基-多羧基的混合物。不同的两性电解质有不同的pH梯度范围,既有较宽的范围如pH=3~10,也有各种较窄的范围如pH=7~8。要根据待分离样品的情况选择适当的两性电解质,使待分离样品中各个组分都在两性电解质的pH范围内,两性电解质的pH范围越小,分辨率越高。
等电聚焦多采用水平平板电泳,也使用管式电泳。由于两性电解质的价格昂贵,使用1~2 mm厚的凝胶进行等电聚焦价格较高。使用两条很薄的胶带做为玻璃板间隔,可以形成厚度仅0.15 mm的薄层凝胶,大大降低成本,所以等电聚焦通常使用这种薄层凝胶。由于等电聚焦过程需要蛋白质根据其电荷性质在电场中自由迁移,通常使用较低浓度的聚丙烯酰胺凝胶(如4%)以防止分子筛作用,也经常使用琼脂糖,尤其是对于分子量很大的蛋白质。制作等电聚焦薄层凝胶时,首先将两性电解质、核黄素与丙烯酰胺贮液混合,加入到带有间隔胶条的玻璃板上,而后在上面加上另一块玻璃板,形成平板薄层凝胶。经过光照聚合后,将一块玻璃板橇开移去,将一小薄片湿滤纸分别置于凝胶两侧,连接凝胶和电极液(阳极为酸性如磷酸溶液,阴极为碱性如氢氧化钠溶液)。接通电源,两性电解质中不同的等电点的物质通过电泳在凝胶中形成pH梯度,从阳极侧到阴极侧pH值由低到高呈线性梯度分布。而后关闭电源,上样时取一小块滤纸吸附样品后放置在凝胶上,通电30 min后样品通过电泳离开滤纸加入凝胶中,这时可以去掉滤纸。最初样品中蛋白质所带的电荷取决于放置样品处凝胶的pH值,等电点在pH值以上的蛋白质带正电,在电场的作用下向阴极移动,在迁移过程中,蛋白质所处的凝胶的pH值逐渐升高,蛋白质所带的正电逐渐减少,到达pH=pI处的凝胶区域时蛋白质不带电荷,停止迁移。同样,等电点在上样处凝胶pH以下的蛋白质带负电,向阳极移动,最终到达pH=pI处的凝胶区域停止。可见等电聚焦过程无论样品加在凝胶上什么位置,各种蛋白质都能向着其等电点处移动,并最终到达其等电点处,对最后的电泳结果没有影响。所以有时样品可以在制胶前直接加入到凝胶溶液中。使用较高的电压(如2000V,0.5mm平板凝胶)可以得到较快速的分离(0.5~1小时),但应注意对凝胶的冷却以及使用恒定功率的电源。凝胶结束后对蛋白质进行染色时应注意,由于两性电解质也会被染色,使整个凝胶都被染色。所以等电聚焦的凝胶不能直接染色,要首先经过10%的三氯乙酸的浸泡以除去两性电解质后才能进行染色。
等电聚焦还可以用于测定某个未知蛋白质的等电点,将一系列已知等电点的标准蛋白(通常pI在3.5~10之间)及待测蛋白同时进行等电聚焦。测定各个标准蛋白电泳区带到凝胶某一侧边缘的距离对各自的pI值作图,即得到标准曲线。而后测定待测蛋白的距离,通过标准曲线即可求出其等电点。
等电聚焦具有很高的灵敏度,特别适合于研究蛋白质微观不均一性,例如一种蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现单一带,而在等电聚焦中表现三条带。这可能是由于蛋白质存在单磷酸化、双磷酸化和三磷酸化形式。由于几个磷酸基团不会对蛋白质的分子量产生明显的影响,因此在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现单一带,但由于它们所带的电荷有差异,所以在等电聚焦中可以被分离检测到。同功酶之间可能只有一两个氨基酸的差别,利用等电聚焦也可以得到较好的分离效果。由于等电聚焦过程中蛋白质通常是处于天然状态的,所以可以通过前面介绍的活性染色的方法对酶进行检测。等电聚焦主要用于分离分析,但也可以用于纯化制备。虽然成本较高,但操作简单、纯化效率很高。除了通常的方法,制备性等电聚焦也可以在垂直玻璃管中的梯度蔗糖溶液或颗粒状凝胶如Sephadex G-75中进行。

二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D―PAGE)编辑本段回目录

二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术(根据蛋白质等电点进行分离)以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(根据蛋白质的大小进行分离)。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。通常第一维电泳是等电聚焦,在细管中(φ1~3 mm)中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦,变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出,用含有SDS的缓冲液处理30 min,使SDS与蛋白质充分结合。将处理过的凝胶条放在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上,加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。在第二维电泳过程中,结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS-聚丙烯酰胺凝胶,在浓缩胶中被浓缩,在分离胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000~2000个蛋白质,有些报道可以分辨出5000~10000个斑点,这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率,它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。例如将某个蛋白质的mRNA转入到青蛙的卵母细胞中,通过对转入和未转入细胞的提取液的二维电泳图谱的比较,转入mRNA的细胞提取液的二维电泳图谱中应存在一个特殊的蛋白质斑点,这样就可以直接检测mRNA的翻译结果。二维电泳是一项很需要技术并且很辛苦的工作。目前已有一些计算机控制的系统可以直接记录并比较复杂的二维电泳图谱。

毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)编辑本段回目录

   毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE), 是近年来发展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75 内径毛细管柱内用高电压进行分离, 创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988~1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内, 由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶,抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求, 得到了迅速的发展。CE是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。CE和高效液相色谱法(HPLC)相比, 其相同处在于都是高效分离技术, 仪器操作均可自动化, 且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异在于:CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间, CE的分析时间通常不超过30min, 比HPLC速度快;对CE而言, 从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比, 对扩散系数小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多;CE所需样品为nl级, 最低可达270fl, 流动相用量也只需几毫升, 而HPLC所需样品为μl级, 流动相则需几百毫升乃至更多;但CE仅能实现微量制备, 而HPLC可作常量制备。CE和普通电泳相比, 由于其采用高电场, 因此分离速度要快得多;检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外, 其它类型检测器均已和CE实现了连接检测;一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近;CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。总之, CE的优点可概括为三高二少:高灵敏度, 常用紫外检测器的检测限可达10-13~10-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-19~10-21mol;高分辨率, 其每米理论塔板数为几十万;高者可达几百万乃至千万, 而HPLC一般为几千到几万;高速度, 最快可在60s内完成, 在250s内分离10种蛋白质, 1.7min分离19种阳离子, 3min内分离30种阴离子; 样品少, 只需nl (10-9 L)级的进样量;成本低, 只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。由于以上优点以及分离生物大分子的能力, 使CE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。当然CE还是一种正在发展中的技术, 有些理论研究和实际应用正在进行与开发。
 “CE”统指以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离通道, 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。其仪器结构包括一个高压电源, 一根毛细管, 一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中, 带电粒子在电场作用下, 以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。CE所用的石英毛细管柱, 在pH>3情况下, 其内表面带负电, 和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下, 双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗, 粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和, 正离子的运动方向和电渗流一致, 故最先流出;中性粒子的电泳流速度为“零”,故其迁移速度相当于电渗流速度;负离子的运动方向和电渗流方向相反, 但因电渗流速度一般都大于电泳流速度, 故它将在中性粒子之后流出, 从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。
    电渗是CE中推动流体前进的驱动力, 它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动, 使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。但在HPLC中,采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型, 其中心处速度是平均速度的两倍, 导致溶质区带本身扩张, 引起柱效下降, 使其分离效率不如CE。
理论分析表明, 增加速度是减少谱带展宽、提高效率的重要途径, 增加电场强度可以提高速度。但高场强导致电流增加, 引起毛细管中电解质产生焦耳热(自热)。自热将使流体在径向产生抛物线型温度分布, 即管轴中心温度要比近壁处温度高。因溶液粘度随温度升高呈指数下降, 温度梯度使介质粘度在径向产生梯度, 从而影响溶质迁移速度, 使管轴中心的溶质分子要比近管壁的分子迁移得更快, 造成谱带展宽, 柱效下降。一般来说温度每提高1℃, 将使淌度增加2% (所谓淌度, 即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上移动的距离)。此外, 温度改变使溶液pH值、粘度等发生变化, 进一步导致电渗流、溶质分子的电荷分布(包括蛋白质的结构)、离子强度等的改变, 造成淌度改变、重复性变差、柱效下降等现象。降低缓冲液浓度可降低电流强度, 使温差变化减小。高离子强度缓冲液可阻止蛋白质吸附于管壁, 并可产生柱上浓度聚焦效应, 防止峰扩张, 改善峰形。减小管径在一定程度上缓解了由高电场引起的热量积聚, 但细管径使进样量减少, 造成进样、检测等技术上的困难。因此, 加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。液体的导热系数要比空气高100倍。现在有的采用液体冷却方式的毛细管电泳仪可使用离子强度高达0.5mol/L的缓冲液进行分离, 或使用200 直径的毛细管进行微量制备, 仍能达到良好的分离效果和重现性。
    CE现有六种分离模式,分述如下:
 1. 毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis, CZE), 又称毛细管自由电泳, 是CE中最基本、应用最普遍的一种模式。前述基本原理即是CZE的基本原理。
 2. 胶束电动毛细管色谱 (micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC), 是把一些离子型表面活性剂 (如十二烷基硫酸钠, SDS) 加到缓冲液中, 当其浓度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电, 但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度, 故胶束将以较低速度向阴极移动。溶质在水相和胶束相(准固定相)之间产生分配, 中性粒子因其本身疏水性不同, 在二相中分配就有差异, 疏水性强的胶束结合牢, 流出时间长, 最终按中性粒子疏水性不同得以分离。MECC使CE能用于中性物质的分离, 拓宽了CE的应用范围, 是对CE极大的贡献。
 3. 毛细管凝胶电泳 (capillary gel electrophoresis, CGE) 是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性,起类似分子筛的作用, 溶质按分子大小逐一分离。凝胶粘度大, 能减少溶质的扩散, 所得峰形尖锐, 能达到CE中最高的柱效。常用聚丙烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱, 可分离、测定蛋白质和DNA的分子量或碱基数, 但其制备麻烦, 使用寿命短。如采用粘度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚丙烯酰胺, 可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分(Non-Gel Sieving)介质。它能避免空泡形成, 比凝胶柱制备简单,寿命长, 但分离能力比凝胶柱略差。CGE和无胶筛分正在发展成第二代DNA序列测定仪, 将在人类基因组织计划中起重要作用。
 4. 毛细管等电聚焦 (capillary isoelectric focusing, CIEF) 将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。通过管壁涂层使电渗流减到最小, 以防蛋白质吸附及破坏稳定的聚焦区带, 再将样品与两性电解质混合进样, 两端贮瓶分别为酸和碱。加高压(6~8kV)3~5min后, 毛细管内部建立pH梯度,蛋白质在毛细管中向各自等电点聚焦, 形成明显的区带。最后改变检测器末端贮瓶内的pH值, 使聚焦的蛋白质依次通过检测器而得以确认。
 5. 毛细管等速电泳 (capillary isotachor-phoresis,,CITP) 是一种较早的模式, 采用先导电解质和后继电解质, 使溶质按其电泳淌度不同得以分离, 常用于分离离子型物质, 目前应用不多。
 6. 毛细管电色谱 (capillary electrochromatography, CEC) 是将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中, 以样品与固定相之间的相互作用为分离机制, 以电渗流为流动相驱动力的色谱过程, 虽柱效有所下降, 但增加了选择性。此法有发展前景。
毛细管电泳 (CE) 除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外, 其仪器结构也比高效液相色谱 (HPLC) 简单。CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。前三个部件均易实现, 困难之处在于检测器。特别是光学类检测器, 由于毛细管电泳溶质区带的超小体积的特性导致光程太短, 而且圆柱形毛细管作为光学表面也不够理想, 因此对检测器灵敏度要求相当高。当然在CE中也有利于检测的因素, 如:在HPLC中, 因稀释之故,溶质到达检测器的浓度一般是其进样端原始浓度的1%, 但在CE中, 经优化实验条件后, 可使溶质区带到达检测器时的浓度和在进样端开始分离前的浓度相同。而且CE中还可采用堆积等技术使样品达到柱上浓缩效果, 使初始进样体积浓缩为原体积的1/10~1%, 这对检测十分有利。因此从检测灵敏度的角度来说, HPLC具有良好的浓度灵敏度, 而CE提供了很好的质量灵敏度。总之, 检测仍是CE中的关键问题,有关研究报道很多, 发展也很快。迄今为止, 除了原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱(ICP)及红外光谱未用于CE外, 其它检测手段如:紫外、荧光、电化学、质谱、激光等类型检测器均已用于CE。
 与HPLC类似, CE中应用最广泛的是紫外/可见检测器。按检测方式可分为固定波长或可变波长检测器和二极管阵列或波长扫描检测器两类。前一类检测器采用滤光片或光栅来选取所需检测波长, 优点在于结构简单, 灵敏度比后一类检测器高;后一类检测器能提供时间--波长--吸光度的三维图谱, 优点在于在线紫外光谱可用来定性、鉴别未知物。有些商用仪器的二极管阵列检测器还可做到在线峰纯度检查, 即在分离过程中便可得知每个峰含有几种物质;缺点在于灵敏度比前一类略差。采用快速扫描的光栅获取三维图谱方式时, 其扫描速度受到机械动作速度的限制。用二极管阵列方式, 扫描速度受到计算机数据存贮容量大小的限制。由于CE的峰宽较窄, 理论上要求能对最窄的峰采集20个左右的数据, 因此要很好地选取扫描频率, 才能得到理想的结果。

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