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抗酶抗体及酶-抗酶复合物的制备

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抗酶抗体的优点,在于酶和抗体结合时,不需要通过化学交联剂交联,抗体的失活少。在酶复合物形成后,同时就具有酶的活性,遇到相应的底物即呈现催化显色作用。必须注意,抗酶抗体必须用与第一抗体同种来源的动物制备。 

(一)抗酶抗体的制备 

于家兔的两个后足掌内各注入弗氏完全佐剂(含活卡介苗12mg/ml)和过氧化物(5mg/ml) 

的等量混合乳化液0.5ml,两星期后,于两侧腘淋巴结内注入同样液体。一周后静脉注射0.2ml~0.4ml,过氧化物酶液(同样浓度), 并同样强化2-3次,末次注射后一周验血、分离血清即为过氧化物酶抗体。 

(二)酶-抗酶复合物(PAP)的制备 

1.取单价特异性抗酶血清10ml,1.5×104r/min(4℃)离心20min,吸取上清。 

2.于上清液中滴加酶溶液(0.5mg/ml)直至不再产生沉淀,静置1h,1.5×104r/min离心20min。 

3.将沉淀物用冷生理盐水125ml洗三次,每次1.5×104r/min离心20min。 

4.于冰浴下,将沉淀物悬混于4ml HRP(2mg/ml)中。 

5.在pH计监测下,边搅拌边加0.1Mol/L或0.01Mol/L HCl至pH 2.3。此时沉淀已全部溶解,1.5×104r/min离心20min。 

6.吸取上清,用0.1Mol/L NaOH调pH至7.4。

7.量体积,加入1/10容量的0.075Mol/L醋酸钠和0.15Mol/L醋酸铵的等量混合液。 

8.逐滴加入等体积的100%饱和硫酸铵,搅拌20min。1.5×104r/min离心20min。 

9.将沉淀物用50%饱和硫酸铵洗1次,同样离心。 

10.将沉淀物悬混于5ml蒸馏水中,以pH6.75缓冲盐水透析3天,每天换水1次。(缓冲盐水由1.35×104ml生理盐水, 25ml 1.5Mol/L醋酸钠和75ml 2Mol/L醋酸铵配成)。 

11.1.5×104r/min(4℃)离心20min,吸取上清,于OD280nm和OD403nm测定,计算IgG和酶含量及克分子比值。 

12.按0.1ml分装,-20℃保存。 

13.应用时从低温冰箱中取出,立即在37℃水浴中融化

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