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流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)与流式细胞仪及其应用

标签: 流式细胞仪 流式细胞术 细胞因子 血小板

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流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度>95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器,已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断,对淋巴细胞群和亚群进行精确分类,还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备,染色后也能在荧光显微镜下进行观察,在某些实验条件下,活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
流式细胞仪技术,主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光,经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点,当每个细胞经过焦点时,发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置),光检测器把散射光定量转化成电信号,经数字转换器进行数字化后而成整数,然后进行电子存储,以后数据可以调出显示和进行分析。其优点如下:
1、具有操作简便,只要将染色的单个细胞推入仪器中,就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度,而且每次可测出许多数据,一般情况下,每秒可测5000个细胞,能迅速分析和记数大量细胞,并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛,即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析,也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群,既可测定DNA和RNA、测凋亡峰,又可测蛋白含量,特别是胞浆蛋白。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型(又称小型机、台式机)和综合型(又称大型机、分析型)。ECKMAN-COULTER公司的产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL等, B-D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型,除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,多用于科学研究。

目录

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流式细胞仪编辑本段回目录

流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。
主要技术指标
1.流式细胞仪的分析速度:
一般流式细胞仪每秒检测1000~ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度:一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差>5%即可区分。
3.前向角散射(FSC)光检测灵敏度:前向角散射(FSC)反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm~0.5μm。
4.流式细胞仪的分辨率:通常用变异系数CV值来表示,,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
5.流式细胞仪的分选速度:一般流式细胞仪分选速度>1000个/秒,分选细胞纯度可达99%以上。
  主要构造和工作原理:流动室及液流驱动系统 编辑本段回目录流动室(Flow Cell或Flow Chamber)是流式细胞仪的核心部件,流动室由石英玻璃制成,单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光垂直相交,在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动,控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成,只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向,能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而使激光激发的荧光信息准确无误。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种,供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。
主要构造和工作原理:激光光源及光束形成系统
    流式细胞仪可配备一根或多根激光管,常用的激光管是氩离子气体激光管,它的发射光波长488ηm,此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633ηm)和/或紫外激光管。
流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的,荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关,激光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照,正是能达到这一要求的理想的激发光光源。
    在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜,将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μm×66μm),在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致。
主要构造和工作原理:光学系统
    流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成,大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成,透镜和小孔(一般为2片透镜、1个小孔)的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束,使激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致,最大限度的减少杂散光的干扰;流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成,滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。滤光片主要有三类:长通滤片(LP)--只允许特定波长以上的光线通过,短通滤片(SP)-- 只允许特定波长以下的光线通过,带通滤片(BP)-- 只允许特定波长的光线通过,不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT),如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525, 接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575, 接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。
主要构造和工作原理:信号检测系统 
    当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射(Forward Scatter, FS)和侧向角散射或900散射(Side Scatter, SS),散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备(如染色)无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光,它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。
前向角散射(FS)反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号;侧向角散射或900散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。
流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm)。488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)、PI(碘化丙啶)、CY5(化青素)、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是:
 激发光波长(ηm) 发射光峰值(ηm)
FITC 488 525(绿)
PE 488 575(橙红)
PI 488 630(橙红)
ECD 488 610(红)
CY5 488 675(深红)
PreCP 488 675(深红)
各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。
主要构造和工作原理:信号存储、显示、分析系统
(一) 信号存储
存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode(列表排队)方式存入的,采用List mode方式有两大优点:①节约内存和磁盘空间②易于加工处理分析。
(二)信号显示和分析
由于List mode方式数据缺乏直观性,数据的显示和分析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。
1.单参数数据显示和分析  细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显 示,图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值,其单位是道数,可以是线性的,也可以是对数的;纵坐标表示细胞数。一维直方图横坐标是FITC荧光信号相对强度值(对数),纵坐标表示细胞数;图中已根据阴性对照设定适当的“门”(直线门),仪器的计算机就会给出测定值(包括阳性细胞%和平均荧光强度)。
2.双参数数据显示和分析  细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。
3.三参数数据显示和分析  细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对(三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据)用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。三个荧光数据关系用分光图(prism)表示,分光图可直接给出8个数据(如用ABC代表3种荧光,可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-)。
  主要构造和工作原理:细胞分选系统 编辑本段回目录 如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动,可带动细胞流动室高频震动,使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴, 每秒钟形成液滴上万个。每个液滴中包含着一个样品细胞,液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中,不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中,从而实现了分选。

活体流式细胞仪(In vivo Flow Cytometer, IVFC)编辑本段回目录

  活体流式细胞仪(In vivo Flow Cytometer, IVFC) 是一种新的生物医学光学仪器,结合活体(近红外)实时高速影像方法和体外流式细胞仪的概念,可实时检测活体CTC并可以进行定量分析与检/监测,可用于实验室对肿瘤治疗效果的早期实时监测及评估,药物的早期筛选等。
  IVFC技术原理是:带有荧光标记的癌细胞在流动过程中经过放置于血管某处横截面的一束激光,其受激发射的荧光信号通过光电转换和模/数转换在计算机中储存,通过一段时间内检测荧光信号来实时记录循环系统中流过的癌细胞的数量。这种方法主要的特点是不用抽血,可在血管中检测,属于微创体内诊断方法。

浮游植物流式细胞仪编辑本段回目录

  浮游植物流式细胞仪利用流式细胞测量技术,在野外现场快速对水体中的浮游植物进行计数的仪器。与传统的生物医学流式细胞仪相比,具有如下显著特点。
  1)细胞粒径范围大,可测量0.4 um-4000 um间的浮游植物,几乎覆盖自然界的所有浮游植物粒径范围
  2)检测器强大,目前一台标准的浮游植物流式细胞仪CytoBuoy配备6种检测器:前向光散射(FSC)、侧向光散射(SSC)、红色荧光、绿色荧光、橙色荧光和曲度检测器。可以对浮游植物进行分类。
  3)坚固、耐用、轻便,适合野外现场测量,而传统的流式细胞仪非常笨重,只能实验室内使用。
  4)样品不需任何前处理,可以直接测量。传统的流式细胞仪前处理复杂,处理不好就会阻塞管路。
  5)不需外加鞘液,仪器自动采用水样的滤液为鞘液,维护方便。
  6)多版本可选。有便携式机型CytoSense、在线监测型CytoBuoy和水下型CytoSub。
  7)可建立浮游植物专家库,可对自然界水样中的特点浮游植物(如易引发赤潮的硅藻和甲藻)鉴定到种,进行早期预警
  8)新增成像功能,可拍摄特定细胞的显微照片。

流式细胞术Protocal编辑本段回目录

一、样品的制备

流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号,因此,细胞必须做成单个细胞悬浮状态,不能聚集,也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异(如特异单抗),而且不允许渗透至载液中。
标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系,要经Ficoll分离,作单细胞分离处理,但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞,需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等),化学法(EDTA、EGTA和柠檬酸盐)消化分散液或洗液最好用无钙、镁PBS,柠檬酸盐的浓度为40μmol/L,并同时采用机械分散法,将经消化处理的膨松组织,用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可,用PBS洗2~3次后重悬,最好过一下尼龙或不锈钢网筛100μm和20μm。细胞浓度要保证在1-2×106/mL
若标本用于测定单个细胞,需加入1~5 mg/L的DNAase,将有助于阻止破碎细胞释放的DNA造成细胞再聚集,但是若分离的细胞要作DNA含量测定之用时,则切勿加DNAase。
二、悬浮细胞的固定

上述制备的活细胞即可用于流式细胞仪分析,如果染色和流式分析要拖后进行,或为了提高染色效果,则要将细胞预固定。乙醇固定是常用的方法。
1、固定方法:
(1)甲醛法:在细胞悬液中加入等量的8%甲醛(用Hank'S液配)4℃下固定12-18小时。
(2)乙醇法:细胞悬于PBS中,缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇,使终浓度为70%,冰浴30分钟。
(3)丙酮法:于细胞悬液中,缓慢加入冷丙酮,使终浓度为85%。
2、实例:
(1)用预冷的无钙、镁含0.5mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲液,将细胞制成1×106细胞的悬液。
(2)在4℃下逐滴加入3倍体积的95%乙醇,连续搅拌使乙醇终浓度达70%。
(3)该细胞可在4℃下保存数日。
(4)分析前先用1000r/min离心10分钟,弃去乙醇,再将细胞悬于PBS中或要求的试剂中。
三、流式细胞仪分析的应用

(一)非染色细胞的光散射
一个粒子(如细胞)出现在一束光线中,立即会干扰该光束,造成该光束入射光的重分布,该细胞所获能量则以衍散、折射、反射等复杂的参数形式重新发射出来,这些参数与细胞体积、表面构象、内部结构形成函数关系,可测低角前面约10°的光散射及90°的光散射。
一般认为,90°位置的光散射值主要受细胞内部结构所致的光反射和折射影响,而低角前面10°位置的光散射则主要代表细胞大小。光散射测量方法如下:
(1)将细胞悬浮于HBSS中,浓度介于1×106~2×106/mL浓度之间。
(2)以悬浮细胞平衡盐溶液(HBSS)充满含鞘液的细胞贮藏池。
(3)设定细胞流量为500个/S(秒),以获得最佳测定结果。
(二)染色法
1  细胞的碘化丙锭(propiolium iodide PI)染色
PI和EB(溴化乙锭)为同类物质,与EB一样,PI嵌入DNA双螺旋中,可使荧光强度增加约20倍,PI的荧光强度约为EB染色的1.8倍,以488nm波长激发,DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。
1.1  小鼠Lewis肺癌细胞(3LL)DNA含量测定方法
(1)从C57BL/6小鼠上切除肿块,在培养皿内用PBS冲洗;
(2)去除结缔组织及脂肪,剪碎肿块;
(3)小碎片移入1.20×38mm注射针,加压使其通过,于4℃条件下重悬细胞于HBSS中。
(4)将200~300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL),染色3LL细胞,于4℃存放20~30分钟。
(5)测定580~750nm之间的发射荧光,以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。
注:PI染色液:0.1%柠檬酸钠1000mL+PI5mg+1%Nonide P40水。
1.2  培养细胞DNA的流式细胞仪分析
(1)从培养皿中吸去培养基,以HBSS冲洗二次;
(2)加入PI5mL于培养皿中,在4℃放10分钟;
(3)用吸管反复次打细胞,使细胞破坏,胞核释放出来,再行流式细胞仪分析。
1.3  完整细胞DNA的PI染色
(1)70%乙醇固定的细胞悬液,离心,去固定液;
(2)室温条件下加入PI染色一批细胞(105~106细胞/mL),时间为30分钟,然后行流式细胞仪分析。
1.4  光辉霉素和PI的DNA染色
在荧光抗生素光辉霉素和PI联合染色过程中,光辉霉素的供体分子被PI的受体分子接受产生能量转移,该染色技术主要用于实体肿瘤组织,精子细胞及妇科标本,同时也适用于体外培养的细胞。
(1)分离制备的细胞悬液即可使用,若用70%乙醇固定可保存一周。
(2)以PI/光辉霉素染色,4℃1小时(PI为10 mg/L、光辉霉素为10 mg/L)。
(3)染色后进样,以100W汞灯作为激光光源,使用BG123nm阻断滤片,叠加K590型高通滤法(one seep filter)。
2、DNA和RNA的鉴别染色
利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定,非固定细胞核酸,或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果,但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下:
(1)试剂:
溶液A:低温保存,稳定期约2周。
Triton X-100(0.1%) 0.1mL,1mol/L HCL  8mL
1mol/L NacL 15ml蒸馏水76mL,PH1.5(100mL)
溶液B:稳定期数月,最好除菌以后(高压或过滤)贮存。
0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L Nacl15mL
0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L柠檬酸18.5mL
蒸馏水24mL,总体积为99mL pH6.0
吖啶橙母液:
用吖啶橙/蒸馏水配成1mg/mL(致癌物,应小心),吖啶橙应用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀释。
注意:仪器鞘流系统应保持4℃。
氩激光激发波488nm,红色荧光为DNA(F>600nm),绿色荧光为RNA或单链DNA(F>530nm)
(2)方法
①用含15%血清的PBS配制细胞悬液,取0.2mL(8×106细胞/mL),加入0.4mL溶液A,4℃放置45~60秒。
②加1.2mL含吖啶橙的溶液B,室温2分钟。
③应在加入溶液B后10分钟内进流式细胞仪分析。
注意:①细胞数保持恒定;②核酸与吖啶橙的比例;③染色时间及温度。
(三)染色法的应用
1、变性及双链DNA的鉴别染色
(1)试剂:
HBSS内含1000u/mL RNA酶A,0.2mol/L KCl pH1.35
吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4缓冲液,pH2.6。
①2×106细胞悬于1mL HBSS/RNase液中。
②37℃温育1小时。
③将0.2mL细胞悬液(含4×105细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混匀,20℃ 30分钟。
④加2mL吖啶橙染色2分钟。
⑤绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA含量。
2、DNA与癌基因探针双标记测定
这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产物,然后用PI标记DNA,现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤:
(1)制备白血病细胞悬液,用100%甲醇在-20℃固定10分钟。
(2)取50μl50 mg/L的癌基因探针Y13-25(它是一种广谱单克隆抗体,可特异性地直接与N-ras,Ki-ras和Ha-ras三种癌基因编码的21Kd蛋白相结合),4℃作用30~45分钟。
(3)用PB离心洗涤2次,重悬浮于50μL HBSS中(含0.1%叠氮钠和2%小牛血清)。
(4)加入50μL 1:200兔抗鼠IgG,4℃放置30~45分钟。
(5)同(3)洗涤后加入50μL 1:40的FITC标记的羊抗兔IgG,4℃反应30~45分钟。
(6)同(3)洗涤后,细胞用RNA酶消化,室温20~30分钟。
(7)同(3)洗涤后,用PI染液染20分钟。
(8)同(3)洗涤后,用488nm激发波长测定。FITC染色显示ras癌基因表达产物,PI染色显示DNA含量。
注意事项:
①制备样品时,离心次数不宜过多,防止细胞丢失和凝集;
②细胞固定时间不宜过长,不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定剂;
③为了降低本底,应将细胞表面未结合的荧光染料洗净;
④进行双标记沉淀时,应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素。
3、以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料进行细胞周期分析。
(1)试剂:
用培养基配制33 mg/L Brdu及脱氧细胞苷26.4g/mL。
染色液:Hoechst33258溶于PBS,细胞染色24小时后进行分析,据报道染色的稳定时间在30分钟至24小时之间。
(2)方法:
①将Brdu溶液按1:10加入细胞培养液中。
②根据细胞周期时间不同,选择不同时间培养的细胞。
③孵育后,摇散细胞以传代培养。
④直接用染液重悬细胞,进入流式细胞仪分析。
Hoechst33258荧光值在410~580nm之间,需用330~360nm紫外光激发。应特异性结合腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对。因此,不仅特异性标记DNA,亦可标记胸腺嘧啶。在细胞周期分析时,在与细胞孵育过程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶,因此,处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态,并在分裂后G1峰的半峰处产生一新峰,此项技术可用于直接测定细胞G2期及分裂时间。
4、Hoechst33342染色活细胞DNA
(1)试剂:Hoechst 33342,用蒸馏水配成0.25mol/L。
(2)方法:
①制备106/m细胞悬液,以Hoechst33342染色,浓度为5~10 mg/L ,室温下20分钟。
②分析前切勿洗涤细胞。
Hoechst33342可用作细胞DNA的活体染料,据信可在保持细胞活性的同时,呈现出相当好的DNA化学计量关系,激发波在紫外范围350~363nm之间,发射波则在450nm处。
5、以异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyante FIFC)染色蛋白质。
(1)试剂:异硫氰酸荧光素(FIFC)用含40 mg/L RNase的PBS配成0.1~1.0 mg/L浓度。
(2)方法:
①染色前用终浓度70%乙醇固定细胞,至少18小时。
②离心固定细胞,弃去固定液。
③室温下用FIFC染色细胞蛋白,30分钟。
④流式细胞仪分析,使用氩激光,激发波长488nm,荧光发射波长515~535nm。
也可于固定细胞中,以18 mg/L (0.1%柠檬酸盐配制)和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/L RNase,PBS配制)染色20分钟以上可对DNA和蛋白质双重染色,分别呈现红色荧光(DNA)和绿色荧光(蛋白质)。
6、荧光素抗体的应用
该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞,可用荧光素或若丹明标记单克隆抗体处理上述细胞;也可用于测定胞浆中的蛋白质(如凋亡BCL-2蛋白,抗病毒蛋白MXA等)。
用磷酸盐缓冲液Eagle's MEM稀释FIFC连接的抗体内含0.1%叠氮钠、2%牛血清。为判定FIFC抗体的最适度的稀释浓度,向微量滴定板的细胞中加入50μL不同浓度的稀释液,再以荧光显微镜确认最佳染色浓度。使用抗人LEU-I抗体分析时,应稀释成5 mg/L或 0.25 mg/L。无论鼠或人细胞在2×107浓度时其存活率应在90%以上。
方法:
(1)于微量滴定板加入50μL抗体稀释度,再加入50μL细胞悬液,混匀。
(2)冰浴45分钟,离心滴定板(1500r/min 10分钟)。
(3)弃上清,以培养基100μL洗涤细胞沉淀2次,每次洗涤后用1500r/min 10分钟,弃上清。
(4)以1ml预冷的培养基配成1×106细胞/mL的已染色细胞悬液,进样前持续保持冷环境(4℃)。

流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项编辑本段回目录

 (一) 原理
  活细胞表面保留有较完整的抗原或受体,先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合,再用荧光标记的第二抗体结合,根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
(二) 操作步骤
     制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
     胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
                 ↓
         用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为
         5×106~1×107/ml
                 ↓
        取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μl)
        的小玻璃管或塑料离心管,再加50μl 1∶20(用DPBS
        稀释)灭活正常兔血清
                 ↓4℃ 30min
        用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2ml左右
              1000rpm×5min
                 ↓
         弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠
         (或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇
                 ↓ 4℃ 30min
         用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右
              1000rpm×5min
                 ↓
         加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入
         1ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察,
         视细胞浓度加入100~500μl固定液)
                 ↓
         FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
          (标本在试管中可保存5~7天)

  (三) 试剂和器材
  1. 各种特异性单克隆抗体。
  2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体,灭活正常兔血清。
  3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
  4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
  (四) 注意事项
  1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaNO3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
  2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
  3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。
  4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
  附:
  1. DPBS (×10, 贮存液)
    NaCl 80g
    KCl 2g      蒸馏水加至1000ml
    Na2HPO4 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
    KH2PO4 2g
  2. 洗涤液
    DPBS      900ml
    FCS 50ml (终浓度 5%)
    4%NaNO3???50ml (终浓度0.2%)
  3. 固定液
    DPBS    1000ml
    葡萄糖    20g (终浓度2%)
    甲 醛    10ml
    NaNO3   0.2g (终浓度0.02%)

流式细胞术常规检测时的样品制备编辑本段回目录

  (一)直接免疫荧光标记法
  取一定量细胞(约1X106细胞/ml),在每一管中分别加入50μl的HAB,并充分混匀,于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色,可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入),。孵育20-60分钟后,用PBS(pH7.2—7.4)洗1-2次,加入缓冲液重悬,上机检测。本方法操作简便,结果准确,易于分析,适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高,但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰,因此更适用于临床标本的检测。
  (二)间接免疫荧光标记法
  取一定量的细胞悬液(约1X106细胞/ml),先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,再加入荧光标记的第二抗体,生成抗原—抗体—抗抗体复合物,以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低,二抗应用广泛,多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。

最小化非特异性结合的方法编辑本段回目录

1.荧光标记的抗体的浓度应该合适,如果浓度过高,背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2.在使用第一抗体之前,将样品与过量的蛋白一起培育,如小牛血清蛋白(BSA),脱脂干奶酪,或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。
3.在使用第一抗体之后,将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。
通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面,但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合,或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。
4.使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此,在NaN3存在的条件下,将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下,即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子,FC受体决定的背景影响已不再重要。
5.其它:已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景,在多重标记过程中,所有的已标记的抗体应被吸附,避免其他种类蛋白的交叉反应。

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测编辑本段回目录

随着研究的进展,仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括:ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析(limiting dilution analysis,LDA)和单细胞PCR,应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞,此方法可获得较强的细胞内信号,但此方法工作量大、主观性强,难以进行大样本检测,且人肉眼识别能力有很大的局限性,而ELISPOT及单细胞PCR技术,技术性强、劳动强度大,难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现,使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
一、简介

  早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成,如TH1(IL-2,IFN-)与TH2(IL-4,IL-5,IL-10),但这些研究很难外推,因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。近来,Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵,用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集,蓄积,增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下,T淋巴细胞产生少量的细胞因子,通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中,T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来,胞内细胞因子信号较弱,难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子,并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化,且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明,只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子,静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合,即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌,同时采用特殊的化学与抗体选择,确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点:
 快速:流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成,实验流程需6-8小时,实际操作时间为1-2小时,快速简便;
 简便:无需组织培养,可以全血分析,无需分离PBMCs;
 灵敏度高:高度灵敏的荧光标记与检测系统;
 高效:可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子,也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型,进行多参数相关分析;
 安全:减少样本处理与生物源性污染
 接近生物体的分析条件:全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。
二、所需仪器

1. 流式上样管及细胞培养皿或板
2. 25%CO2,37℃孵箱
3. 混匀振荡器
4. 离心机
5. 加样器、Tips
6. 流式细胞仪
三、常用的标本类型和处理方法

全血:使用肝素钠抗凝的真空采血管采血,不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂,血样在8小时内分析,超过8小时会导致活性的损失,一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测,应将真空采血管水平室温放置。
自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs):使用肝素钠抗凝的采血后,分离PBMCs,24小时内分析。
组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs):用Ficoll分离PBMCs,将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中,调节细胞浓度为2×106细胞/ml。
细胞系与T细胞克隆:调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。
冰冻全血与PBMCs:使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs,用PBS漂洗,并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬,-70℃冻存。溶化后细胞置于染色管中,加上2~3mL的洗液,离心5分钟后,用破膜剂对细胞进行破膜和染色。
四、所需试剂

1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂
依据实验需要选择特殊表面标志
CD45圈定所有淋巴细胞
CD3 圈定T淋巴细胞
CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群
CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群
CD19/或CD20圈定B淋巴细胞
CD56圈定NK淋巴细胞
CD14圈定单核细胞
2、荧光标记的细胞因子抗体:R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体
3、溶血素:用外周全血检测时需使用溶血素(R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠;eBioscience目录号00-4333)溶解红细胞
4、激活剂
① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Alexis,目录号ALX-445-004-M001)
A. DMSO中调节浓度0.1mg/mL
B. 分装(20L),-20℃储存。勿反复冻融
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1:100稀释储存液
D. PMA终浓度25ng/mL细胞悬液
② Ionomycin  (Alexis,目录号ALX-450-006-M001)
A. 于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL
B. -20℃储存
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1:10稀释储存液
D. Ionomycin终浓度1g/mL细胞悬液
③ Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)
A. 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL
B. 4℃储存
C. SEB终浓度10g/mL细胞悬液
④ CD3:包被在培养板中,在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞
⑤ CD28:加速不同刺激剂(包括SEB、CD3等)的活化效应,浓度一般为10ug/ml
5、阻断剂
阻断高尔基体介导的转运作用,使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内
① Brefeldin-A(BFA) (eBioscience,目录号00-4506)
A. 于DMSO中调节浓度5mg/mL
B. 分装(20L),-20℃储存。勿反复冻融。
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1:10稀释储存液
D. 激活最后4-5小时BFA终浓度10g/mL细胞悬液。
注意:BFA过度孵育会导致细胞活力下降
② Monensin (eBioscience,目录号00-4505)
6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640
7、 固定剂:细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内,另一方面避免细胞表面抗原丢失。含4%的多聚甲醛PBS溶液(eBioscience,目录号00-8222)
8、 破膜剂:含1%皂甙、0.05%叠氮化钠的Hanks溶液(HBBS)(eBioscience,目录号00-8333)
将细胞膜穿孔,已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内,于相应的细胞因子结合
9、其它试剂:无菌无叠氮钠PBS,乙醇,含1%多聚甲醛的PBS,4℃储存。
五、细胞培养和刺激的基本方法
细胞活化的最终结果是产生细胞因子,根据检测指标和标本的不同,研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间,以获得最佳的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。
表 细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法
检测细胞因子 阳性对照刺激方法
人IFN- 方法2 (4-24 小时)
人TIMP-1 方法5
人TNF- 方法7 (6 小时)
人IL-1 方法3 (6 小时)
人IL-1 方法3 (24 小时)
人IL-2 方法2 (4-24 小时)
人IL-4 方法4
人IL-5 方法1
人IL-6 单核细胞:方法3 (6-12 小时) T细胞:方法6
人IL-10 方法1
人IL-12 方法8
人IL-15 方法3
人Fractalkine/CX3CL1 方法1
人IL-8/CXCL8 方法3 (24 小时)
人MCP-1/CCL2 方法3 (24 小时)
人MIP-1/CCL3 方法3 (24 小时)
人MIP-1/CCL4 方法3 (24 小时)
人RANTES/CCL5 方法1
小鼠IL-2 方法9
小鼠IL-4 方法10
小鼠IL-5 方法10
小鼠IL-6 方法11
小鼠IFN 方法9 or 方法12
小鼠TNF- 方法9
为防止细胞内细胞因子分泌到胞外,在培养的最后4-6个小时,需要使用蛋白转运抑制剂 (如3uM monensin,10mg/ml的BFA)
方法1:  只使用转染细胞检测
方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.
方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.
方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4+细胞在包被人CD3抗体的培养板中,使用含有重组人的IL-2(10 ng/ml,目录号202-IL-010)和IL-4(10 ng/ml,目录号204-IL-005)的培养基培养两天;细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天;最后收获细胞,使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时
方法5: CD4+ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days
方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1 (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)
方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激
方法8: PBMCs细胞使用重组人IFN (10 ng/ml,目录号285-IF-100) 刺激2 小时,然后使用IFN (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.
方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中,使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时
方法10: CD4+T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中,使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体,重组小鼠的IL-2(10 ng/ml,目录号402-ML-020)和IL-4(50 ng/ml,目录号404-ML-005)的培养基培养两天;然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天;最后收获细胞,使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。
方法11: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时
方法12: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时
六、流式检测细胞染色基本过程(以全血为例)
1、 收获细胞:肝素钠抗凝的静脉血,按1:1与培养基混匀,加刺激剂,同时加蛋白转运抑制剂(参照说明书), 混匀后,37℃,5%二氧化碳培养4-6小时
2、 阻断Fc受体:用于消除非特异性的结合染色
① 在小鼠,可使用纯化的FcII/III受体的抗体(CD16/32),按照1ug/106细胞的用量,在染色缓冲液中4℃孵育15分钟,PBS清洗后,直接进行下一步染色。
② 对于人和大鼠,可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断
3、细胞表面染色
① 加适当的细胞表面染色试剂20L于Falcon管中,加入100L激活后的全血 (细胞浓度维持在2×106/mL) 混匀,室温暗处孵育15分钟;
② 加入溶血素,室温暗处孵育10分钟。(注意:PMA激活的全血可能会溶血不完全。)
③ 离心500g 5分钟,弃上清
4、固定和破膜
① 加固定剂,室温暗处孵育15分钟,离心500g 5分钟,弃上清;
② 加破膜剂温暗处孵育10分钟。(剂量参照说明书)
③ 加23mLPBS洗液,离心500g 5分钟,弃上清。
5、细胞内染色
① 加入荧光标记的细胞因子抗体,混匀,室温暗处孵育30分钟。
② 加23mL洗液,离心500g 5分钟,弃上清,加入500LPBS上机或加入500L 1% PFA固定后再上机
七、注意事项

1. 标本处理:避免使用络合钙的抗凝剂,如ACD与EDTA,因为它们会限制钙依赖性激活过程,推荐用肝素钠。此外LPS,一种常见的生物试剂污染物,是强细胞激活剂,可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析,超过8小时会导致活性的损失,一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测,应将真空采血管水平室温放置。
2. 刺激激活:检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间,以保证最佳的检测效果。比如,要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激;如果用CD4做表面标记,由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调,所以培养时间不能太长,4-6小时为宜,否则CD4下调影响分析
3. 选择合适的对照:为保证结合的真是和可靠性,至少荧光设置以下对照:
① 未刺激对照:激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运,因此在激活过程中产生  的抗原与细胞因子会滞留胞内,未刺激对照也应包含BFA。
② 激活对照:激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否,如果未达到CD69期望的水平,则激活步骤出了问题,某一试剂可能失活,过期,制备不当或溶剂污染,需制备新鲜刺激剂重新实验。
③ 同型对照:使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
4. Fc受体阻断:使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色,在小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32(eBioscience, 目录号14-0161-81),在大鼠可以用纯化的抗大鼠的CD32,在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。
5. 荧光素的选择:检测相对低表达细胞因子如IL-4时,应选用PE或APC标记;单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记;同时检测多种细胞因子时,弱表达的应选用PE或APC,FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-γ

八、问题与解答


流式细胞仪分析:血小板的活化编辑本段回目录

一、使用流式分析方法检测血小板活化的优点

1.检测血小板的反应性。
2.了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化,然后是胞浆内颗释放到血小板外。
3. 同时检测多种血小板表面标志。
4. 高度灵敏。
5. 直接检测血小板的多种标志。
6. 使用全血,标本量少。
7. 操作简便快捷,将血小板人工激活减至最低。
二、全血中活化血小板的检测

1. 血小板特异性膜糖蛋白:血小板膜糖蛋白已被深入研究,下表显示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在这些膜糖蛋白中,仅在血小板膜表面表达主要有GPⅠb,GPⅡb,GPⅢa等有限的几种,根据这些特异性糖蛋白制备的荧光单抗,能在全血中特异性地识别血小板。
2. 活化血小板的标志物:活化血小板与静息血小板相比,其质膜糖蛋白常发生显著的变化,这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物,这些标志物可分为三类:第一类是血小板颗粒膜上的糖蛋白。血小板被激活时,其颗粒膜与质膜发生融合,颗粒膜蛋白,如CD62、CD63,在质膜上表达,成为活化血小板的分子标志。第二类是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa(CD41/61)的PAC1表位,它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。因此,使用这个表位的荧光单抗,我们能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。另外,GPIV (CD36)虽然在静息血小板上也表达,但活化血小板上表达量更高;GPIb-IX-V复合物(CD42)则相反,与静息血小板相比,活化血小板上表达量显著降低。第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原,包括纤维蛋白原,Xa因子和thrombospondin等。这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。
3. 除检测免疫性的分子标志物外,流式细胞术还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。如用Ca2+浓度敏感的荧光染料检测胞内Ca2+流,用能进入血小板致密颗粒的荧光染料阿的平来检测活化血小板的释放功能等。
4. 单抗的选择:与血小板有关的CD单抗有CD9,CD31,CD36,CD41a-b,CD42a-d,CD61(特异的泛血小板表面标记,既与活化血小板结合,也与未活化血小板结合。CD61与CD41联合,即为血小板表面gpⅡb/Ⅲa复合物),CD62,CD63 ,CD107a-b等,。活化血小板的检测需选择针对活化血小板标志物的CD单抗。表2列举了活化血小板检测的一些代表性单抗。
三、操作步骤

1.  标本采集:
(1) 枸橼酸钠抗凝的真空采血管顺序编号。
(2) 抽取静脉血,采血管中注入2ml。
(3) 于10分钟之内完成血小板激活和染色步骤,操作时应注意减少人工激活。
2.  血小板激活:
(1) 试管内加入50mlADP(也可选用其他激活剂,如PMA、纤维蛋白、TRAP),450l全血,轻轻摇匀。
(2) 室温孵育5分钟。
(3) 立即染色。
3.  荧光抗体染色:
(1) Falcon管编号。
(2) 在对照管中加入同型对照、CD61、PAC-1和RGDS(PAC-1的阻断剂)。
(3) 在试验管中加入CD62P、CD61和PAC-1。
(4) 在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本5l。
(5) 轻轻混匀,室温暗处孵育15-20分钟。
(6) 各管中加入1ml冷的固定液 (2-8C),充分混匀, 2-8C阴暗处放置30分钟。
(7) 24小时内上机分析。
4.  结果分析:
在CD61 vs SSC点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群,
CD61阳性/低SSC一群主要由单个血小板组成,CD61阳性/高SSC一群主要由黏附血小板的血细胞组成, CD61阳性/散射光更低的一群主要由血小板来源的碎片组成。由于在生理和病理情况下,血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉,因此,不建议使用FSC-SSC图设门。 在CD61 vs SSC点图中找出CD61 阳性的血小板群 (单个血小板和黏附在WBC上的血小板),设门。
注意事项

1. 采血时请用大号针管,抽出的前2ml血应弃去不用。
2. 尽量避免标本受到物理振动。
3. 取血后10分钟内完成染色操作。
4. 在Falcon管中加血标本5l,管壁上不能有残留血,未染色的部分会影响试验结果。
5. 为了检测和控制血小板体外激活,建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制。

血小板的流式细胞术分析编辑本段回目录

血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术,它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法,丰富了血小板功能评估指标。 
一、流式细胞仪血小板分析应用范围
1. 通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成,分析血小板活化,血小板对刺激物的反应性。
2. 通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测,分析血小板止血功能的获得性和遗传性缺陷。
3. 结合血小板大小,检测血小板RNA含量,分析血小板成熟度,计数网织血小板。
4. 发现血小板抗体,做定性和定量分析。

二、血小板分析的临床意义
1. 血栓性疾病:活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性,非风湿性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化,胰岛素依赖性糖尿病,子痫前期,外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板,而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的体外激活能力降低。
2. 血小板缺陷性疾病:全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病,如巨大血小板综合征,血小板无力症等。前者是由于GPIb-IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大,功能异常的出血性疾病。后者由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷,导致血小板聚集功能障碍
3. 贮存池疾病:原发性贮存池疾病(δ-SPD)常规用血小板聚集法检测,但特异性和灵敏度均不理想。检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法,主观性大,操作繁琐,而且一次检测的血小板数目有限。全血法流式细胞术为δ-SPD的诊断提供了一个简单、迅速的方法,一次能定量检测5 000个以上阿的平染色的血小板。与正常人相比,δ-SPD患者阿的平染色显著下降(从49%降至15%)。常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病,也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。
4. 血小板减少性疾病:破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。血小板相关抗体(PAIg)是反映血小板的破坏的指标,虽然其临床意义仍有争议。PAIg的检测有多种方法,但流式细胞术法有其优越性。流式细胞仪能测定单个血小板上的PAIg,只要测定104甚至103个血小板,在统计学上就能精确地得出PAIg的平均水平,因而用血量少,只要1 ml血液制备的血小板就足够。流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标,如PAIgG、PAIgM、C3等。血小板的生成与巨核细胞有关,全血法流式细胞术能像检测网织红细胞那样,检测分泌到循环中的“网织”血小板,来判断血小板的生成。“
5. 血小板储存与输注:用P-选择素(CD62)、CD63、GPⅡb/Ⅲa作分子标志物,发现血库中储存血小板有时间依赖性的活化现象。储存5天以上,40%~60%血小板表达活化标志CD62。虽然其形态改变、乳酸脱氢酶泄漏以及β-TG的释放也能反映其活化,但用CD62作为储存血小板的质量控制指标最理想。活化的血小板在循环中的存活时间很短。若血小板在储存时活化了,即使输注也不能很好地提高患者止血能力。
6. 抗血栓药物的监测:活化血小板的检测可以判断患者是否需要抗血栓药物治疗,也可以监测这些抗血栓药物的作用,避免毒副反应的发生。
7. 此外,全血法流式细胞术还可用于检测血小板聚集,研究其免疫表型HPA-Ⅰa,测定严重血小板减少患者的血小板数目。

三、流式细胞仪分析全血中血小板的优点
1. 全血中血小板更接近生理状态。
2. 操作简便,减少由于操作造成的血小板状态改变(如血小板活化试验)。
3. 同时检测血小板的多个标志物,结合FSC和SSC,评估多个参数,进行定量分析。
4. 多采用血小板特异抗体CD41或CD61画门,找出血小板,避免杂质碎片的干扰。
5. 检测血小板亚群灵敏度高。
6. 用血量少。
7. 无放射性污染。

四、全血样本的制备
1.抽取抗凝全血:检测血小板功能时,应使用标准化的抽血规程。做血小板活化试验时,应尽量减少人为造成的血小板活化。
2.Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体,充分混匀,室温避光处反应,通常放置15分钟。
3.1%多聚甲醛固定样本。
4.上机检测

五、质控标本
1. 阴性对照(Isotype Control):非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度,应与试验管抗体相对应。在多色分析时,同型对照应与其它抗体同时使用,以避免补偿造成的误差。
2. 血小板体外活化试验:使用正常人活化标本作为阳性质控。使用正常人未活化标本作为阴性质控。
3. 血小板自身抗体检测:使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育,作为阳性质控。使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育,作为阴性质控。
4. 血小板表面抗原缺失:如巨血小板症血小板表面CD42a/CD42b缺失,血小板无力症血小板表面gpIIb/IIIa,即CD41/CD61缺失或异常。使用正常人标本做阳性对照,抗体的同型对照做阴性对照。

六、数据分析 

当前临床流式细胞分析的发展方向和趋势编辑本段回目录

    流式细胞分析(Flow cytometry,FCM)是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术,它具有如下几个特点:①标本只要是单细胞即可用于分析,如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等,实体组织只要经处理后制成单细胞悬液也能分析,因此,实际上所有组织细胞均可用于分析。②极短时间内可分析大量细胞,只要标本中的细胞数量足够,流式细胞仪(Flow cytometer)可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量,测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。③可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数更为准确。④定性或定量分析细胞:通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性、细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。

  由上述几个主要特点可知,FCM是一种在医学基础、临床及科学研究中有着广泛的应用前景的细胞分析技术,尤其是随着人类基因组计划完成后,流式细胞分析在单细胞水平研究基因的表达、调控及功能等也将有着更广泛的应用。近年来,随着流式细胞仪性能的不断改进和测定方法与技术的迅速发展,流式细胞仪迅速进入临床实验室,临床流式细胞分析(Clinical flow cytometry)在临床检验医学中的应用范围不断拓宽,一些检验项目已成为临床疾病诊断、治疗方案选择、预后判断等不可缺少的内容。

  当前,临床流式细胞分析已成为检验医学发展的一个热点,其发展趋势主要体现在以下几个方面。 

一.从相对细胞计数到绝对细胞计数

  流式细胞分析最大的优点是对混合细胞群体中亚群细胞的计数,如淋巴细胞可依其表面标志的不同分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-),T淋巴细胞又可进一步分为辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+CD8-)和抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD4-CD8+)等。这些亚群细胞计数过去多以相对百分比表达结果,由于百分比只能代表每种细胞在混合细胞群体中所占的比例,并不能体现在单位体积血液中的绝对数量,而现在临床一些疾病的诊断需要考虑细胞的绝对数量,如艾滋病患者的血液中辅助/诱导T细胞(CD3+CD4+CD8-)<200个/μL,而仅有HIV感染而未发病者的>200个/μL。T淋巴细胞亚群的绝对计数在国外实验室早已成为常规检查,而国内仅有少数实验室开展。

  流式细胞绝对计数在临床可开展的项目包括:①淋巴细胞亚群,尤其是T淋巴细胞亚群的绝对计数。②外周血或骨髓中造血干/祖细胞的绝对计数。③血液中网织红细胞的绝对计数。④血液中血小板数量,尤其是血小板减少症患者血小板的绝对计数,此种计数优于血细胞分析仪法,已成为血小板计数的国际推荐参考方法。此外,可能出现在血液中的其它一些稀少细胞(如内皮细胞、转移的肿瘤细胞等)的计数,也将发展为流式细胞绝对计数。流式细胞绝对计数的开展对临床疾病的诊断、治疗等有重要意义。

二.从相对定量到绝对定量分析

  细胞的多种成分如某些抗原或受体表达的流式细胞分析,以前多以平均荧光强度(MFI)或相对荧光强度(RFI)表达其含量。由于流式细胞仪每次的仪器状况可出现差异,每个实验室所用仪器的类型也不尽相同,以MFI或RFI表示某些细胞的抗原或受体的表达量缺乏可比性,虽然流式细胞仪有极高的荧光灵敏度,但却无法准确应用这些信息。近年来,为了通过FCM精确定量分析细胞的某些成分,定量流式细胞术(Quantitative flow cytometry,QFCM)逐渐得到发展,其定量分析原理主要有两种:①定量抗体微球法:在特制的微球上包被已知分子数的羊抗鼠IgG分子,再将包被不同分子数的微球混合,形成含不同羊抗鼠IgG分子数的混合微球,此微球与待测标本在相同条件下与荧光素标记的单克隆抗体(McAb)反应后在流式细胞仪上测定其荧光强度,根据微球上所包被的羊抗鼠IgG分子数和与之对应的对数荧光强度计算回归方程,再将待测样本中阳性细胞的对数荧光强度代入方程即可求得其每个细胞上的平均抗原分子数(抗原结合位点数)。②定量荧光素分子微球法:在特制的微球上直接包被荧光素分子,再将包被不同分子数的微球混合,形成含不同数量荧光素分子的混合微球。在流式细胞仪仪器设置相同的条件下测定此微球及待测细胞的荧光强度,根据微球上所包被的荧光素分子数和与之对应的对数荧光强度计算回归方程,再将待测样本阳性细胞的对数荧光强度代入方程,可求得每个细胞上的平均荧光素分子数,根据所用于样本测定的单克隆抗体(McAb)与荧光素结合的分子比例,计算每个细胞上的平均抗原分子数。单细胞的抗原或受体定量是流式细胞分析的重要进展,为研究细胞的生物学、生物化学及免疫学等性质提供了更精确的方法。例如,白血病性原始细胞的膜CD45分子表达量低于正常淋巴细胞,活化血小板膜CD62P、CD41分子数显著高于静止血小板,活化淋巴细胞的CD69分子数显著增高,活化中性粒细胞膜CD64分子数显著高于静止中性粒细胞,强直性脊柱炎患者T淋巴细胞膜HLA-B27分子数明显增高。CD8+T淋巴细胞膜CD38分子数增高是慢性HIV感染者病情发展或死亡的更有力的预后指标;AIDS治疗有效后,CD8+T淋巴细胞CD38分子数降低。

三.从单色到多色荧光分析

  流式细胞分析从最初的间接免疫荧光染色、单色或双色直接荧光染色,一般只能分析单细胞的一种或两种信息。随着新的荧光色素分子的不断发现,荧光标记技术的进步和流式细胞仪的多激光激发等技术的进展,多色荧光分析得到迅速发展,三色、四色甚至五色或六色荧光分析对细胞亚群的识别、细胞功能评价等更为精确。目前,淋巴细胞亚群的分析、白血病免疫表型分析均应使用至少三色荧光以上分析才更可靠。例如:辅助/诱导T淋巴细胞四色荧光分析的免疫表型为CD3+CD4+CD8—CD45+,慢性淋巴细胞白血病的异常淋巴细胞的四色免疫表型为CD5+CD10—CD19+CD45+。多色荧光分析是流式细胞技术发展的必然趋势,有条件时应尽可能地采用。

四.从细胞膜成份到细胞内成份分析

  流式细胞膜免疫表型分析是最重要的分析内容之一,很多细胞亚群的检测均是以膜免疫表型为主,如T、B淋巴细胞和NK细胞分析、白血病免疫分型等。然而,仅有膜免疫表型的分析是不够的,尤其对一些细胞的系列鉴定和功能状态分析常较为困难,而细胞浆或细胞核内成份则更能反映某些细胞的系列特征和功能变化。随着近年来细胞内成分检测技术的不断完善,细胞内成分检测已成为流式细胞分析的又一个热点。例如,急性髓系白血病性原始细胞浆中检测到髓过氧化物酶(MPO)是最为准确的系列标志,急性B淋巴细胞白血病性原始细胞浆中检测到CD79a是最为特异的系列标志;检测T淋巴细胞胞浆内细胞因子合成的种类及含量和膜CD69分子表达,是判断T淋巴细胞活化及其功能的重要手段,而且还能将辅助/诱导T淋巴细胞(Th)进一步分成Th1和Th2亚类,在Th1和Th2细胞浆中可分别合成γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-1(IL-1)和IL-4、IL-5、IL-10。通过细胞内成分检测技术与多色免疫荧光分析方法结合,可检测不同细胞亚群合成的不同细胞因子(Cytokine),如用五色疫荧光分析血液中淋巴细胞经诱导剂刺激后,辅助/诱导T淋巴细胞亚类—Th1细胞内有细胞因子合成的免疫表型为CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+。

五.液体中可溶性成分的流式细胞分析

  从传统意义上讲,流式细胞技术只能分析细胞及其成分,液体中的可溶性成分则不能进行分析。然而,如果将液体中的可溶性成分结合在一种类似于细胞大小的颗粒(如乳胶颗粒)上,流式细胞仪便可以对其进行分析,这就是近年来发展起来的流式微球分析(Cytometric bead assay,CBA)技术。CBA的原理是将包被某种抗原或抗体的不同大小的微球与待测液体中的相应成分反应形成抗原与抗体的复合物,再加入荧光素标记的第二抗体,微球上结合的待测抗原或抗体分子数量与其荧光强度呈线性关系,由此可对待测液体中与微球上包被抗原或抗体分子相对应的成分进行定性或定量分析,例如同时测定血清或细胞培养液中的多种细胞因子,同时测定血清中多种自身抗体。CBA发展的时间虽很短,目前所能检测的项目还不多,但极具发展潜力。已知检测细胞因子的方法有多种,包括靶细胞功能分析法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点酶免疫分析(Elispots)等,但CBA与之相比,其灵敏度极高、可达2 pg/ml,而且能同时测定单个标本中的多种细胞因子。

六.流式分子表型分析

    流式分子表型分析(Molecular phenotyping)是指用流式细胞技术检测细胞中特异性核酸序列或特异性基因异常。流式分子表型分析与免疫表型分析技术相结合,对于检测所选择细胞亚群的特异性核酸序列(如癌基因、病毒核酸等)检测,提供了一种非常有用的工具,具有广阔的应用前景。流式分子表型与免疫表型结合分析的基本技术路线是:①待测细胞首先与特异性细胞亚群的单克隆抗体反应,②固定并渗透细胞,③通过PCR进行引物特异的核酸序列扩增,④应用对扩增产物的特异性寡核苷酸荧光素标记探针进行荧光原位杂交(FISH),⑤加入针对细胞亚群单抗的荧光素标记的第二抗体。⑥流式细胞仪检测及数据分析。例如,流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光原位杂交(PCR-FISH)结合测定血液CD4+细胞中HIV特异的DNA或RNA,对于AIDS的病程监测、治疗反应及预后等有重要价值。流式荧光原位杂交(Flow-FISH)法测定染色体端粒长度:细胞的染色体端粒是由2~20 Kb串联的短片段重复序列(TTAGGG)n和一些结合蛋白组成,端粒长度越长,所含重复碱基数目越多;用荧光素标记的核酸-(CCCTAA)3端粒序列特异性探针进行FISH后经流式细胞仪检测,其荧光强度的高低可反映端粒的长短;Flow-FISH可测出小于3Kb的端粒长度差,对肿瘤的发生与发展、治疗与预后等的研究有一定价值。

各学科研究中的应用编辑本段回目录

①细胞生物学:定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞;分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系,进行染色体核型分析,并可纯化X或Y染色体。
②肿瘤学:DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术,对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。
③免疫学:研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系;进行免疫活性细胞的分型与纯化;分析淋巴细胞亚群与疾病的关系;免疫缺陷病如艾滋病的诊断;器官移植后的免疫学监测等。
④血液学:血液细胞的分类、分型,造血细胞分化的研究,血细胞中各种酶的定量分析,如过氧化物酶、非特异性酯酶等;用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系,检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞,以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血;检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病,如红斑狼疮等。
⑤药物学:检测药物在细胞中的分布,研究药的作用机制,亦可用于筛选新药,如化疗药物对肿瘤的凋亡机制,可通过测DNA凋亡峰,Bcl-2凋亡调节蛋白等。
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细胞凋亡研究编辑本段回目录


 细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡,在疾病发生、发展中有重要作用,因而研究细胞凋亡有重要意义。细胞凋亡检测方法很多,应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。
1. 细胞形态变化:通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化来观察细胞凋亡。在细胞凋亡早期,细胞前向角光散射的能力显著降低,90°角光散射的能力增加;在细胞凋亡晚期,前向角和90°角光散射的信号均降低。此方法特异性不强,目前使用较少。
2 细胞膜功能改变:
(1) 磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine PS)异位:正常情况下,PS位于细胞膜内层,细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层,是细胞发生凋亡的早期事件。PS与Annexin Ⅴ(一种具有强力抗凝作用的血管蛋白)具有高度亲和力。应用流式细胞仪采用FITC- Annexin Ⅴ/PI双染法进行细胞凋亡检测,可同时描述三群不同状态细胞:FITC- Annexin Ⅴ-/PI-细胞,即正常活力细胞;FITC- Annexin Ⅴ+/PI-细胞,即凋亡细胞;FITC- Annexin Ⅴ+/PI+细胞,即已死亡细胞。此种方法操作过程简单,指标敏感,应用者越来越多。
(2) PI/Hoechst33342双染法:Hoechst33342(HO)是一种DNA的特异性荧光染料,可通过完整细胞膜,应用PI/Hoechst33342可将细胞分为三群:正常活细胞(HO强/ PI-),凋亡细胞(HO弱/ PI-),(由于凋亡细胞发生DNA降解和丢失,导致HO荧光减弱),死亡细胞(HO弱/ PI+)。此种方法再结合凋亡细胞前向角光散射能力降低的特点,能更好地鉴定凋亡细胞,但HO须紫外光激发,由于很多流式细胞仪不配有紫外激光,故此法应用受限。
(3) 吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)双染法: AO是一种异染性荧光染料,可通过完整的质膜,它与核酸的结合主要是嵌入DNA双链的碱基之间,其发射峰为530nm,呈绿色荧光。EB的理化特性与PI相似,不能通过完整质膜。应用AO/EB双染法也可以将细胞分成三群:正常活细胞(AO强/ EB -),凋亡细胞(AO弱/ EB -),死亡细胞(AO弱/ EB +),原理与PI/Hoechst33342双染法相似,不同的是AO/EB双染法所的激发光是被广泛使用的氩激光(488nm),而不须紫外光,其缺点是染色过程较复杂,且AO易污染设备管道,因此使用此法者较少。
(4) 放线菌素D(7-AAD)染色法:7-AAD是一种核酸染料,它不能通过正常质膜,随着细胞凋亡、细胞死亡过程,质膜对7-AAD的通透性逐渐增加,结合细胞凋亡中DNA的有控降解,最后通过7-AAD标记DNA的强弱,将细胞分为三群:7-AAD强为死亡细胞,7-AAD弱是凋亡细胞,7-AAD-为正常活力细胞。此法具有染色快速、简便、价格便宜等优点。另外,由于此法不破坏细胞膜,故还可联合使用FITC、PE标记的膜蛋白,对特殊细胞群及亚群进行多色荧光分析(虽然AO/EB双染法也不破坏被检细胞膜,但由于AO及EB的发射光波谱分别与FITC和PE的发射光波谱相似,故AO/EB法不能与FITC和或PE联合使用)。此法是应用核酸染料测定细胞凋亡的流式细胞仪法中十分实用的方法。
     3. 细胞器改变:  线粒体膜APO2.7蛋白表达:早期凋亡细胞的线粒体膜出现APO2.7蛋白表达,利用荧光标记的单克隆抗体,运用流式细胞术可以检测早期凋亡细胞。
    4 .DNA含量变化:
    主要是PI染色法,由于凋亡细胞DNA发生有序降解,被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜(经乙醇及透膜剂处理)漏出细胞外,使得凋亡细胞内的DNA含量减低,在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方图中G1峰前可出现亚二倍体峰,即所谓凋亡峰。通过测定凋亡峰百分含量,便可知凋亡细胞比例。此法简便、快速,是目前常用的、经典的测量凋亡细胞的方法。此法存在问题:少量的正常的低DNA含量细胞、由于机械损伤产生DNA含量减低的坏死细胞、染色体丢失的分裂相细胞以及细胞碎片和微核等都可能出现在亚二倍体峰内。因此,此法的特异性较低。
5. DNA断裂点标记:细胞凋亡时发生DNA断裂,利用末端转移酶(TdT)可以将dUTP标记到断裂点上,称作原位缺口末端标记(TUNEL)技术。此法有直接标记和间接标记两种,前者的标记物是FITC-dUTP,后者的标记物是生物素(biotin)标记的dUTP,需要再用FITC标记的亲和素(avidin)与生物素标记的dUTP结合,使标记反应倍增,故间接标记法灵敏度高,但操作较复杂。TUNEL还可以配合其它单抗同时进行细胞表型分析,或与DNA含量同时分析。TUNEL法因其灵敏度高而被广泛采用。
    6 细胞凋亡相关基因产物检测:细胞凋亡是一个多种基因参与的复杂过程,目前已知与bcl-2基因、c-myc基因、P53基因等有关,这些基因都有相关产物,目前针对这些相关产物已有单克隆抗体生产,应用这些单抗,通过流式细胞仪可检测造血细胞凋亡相关基因蛋白表达水平,相互关系。
    流式细胞仪测定细胞凋亡方法、层次众多,且具有快速、准确特点,应用十分广泛。在实际应用中应注意采用多种方法结合使用,使结果更加可靠准确。
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细胞分选编辑本段回目录


    流式细胞仪能够分选某一亚群细胞,分选纯度>95%。目前细胞分选主要用于研究,临床应用较少。血液学应用最多的是造血干细胞的研究,最近随着造血理论的深入研究关于造血干细胞究竟是否都是CD34+细胞出现一些争论,实验研究证明, CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞更具造血潜能,这些实验研究所用的CD34- 和CD34+细胞就是通过细胞分选获得的。小鼠造血干细胞分选一般按lin-c-Kit+CD34+/ lin-c-Kit+CD34-分选,人造血干细胞分选一般按lin-CD34+/ lin-CD34-分选。
 为避免某些遗传性血液病如海洋性贫血、异常血红蛋白病的纯合子出生,产前诊断非常重要,这些疾病的主要靶细胞是红细胞,而孕妇血循环中存在着胎儿有核红细胞,只是数量非常少,利用流式细胞仪可从孕妇血液中分选出胎儿有核红细胞(分选条件:CD45-GPA+)进行基因分析,作出产前诊断。
利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题。总之,流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞,只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记,流式细胞仪的分选功能将得到越来越多的科学研究和临床应用。
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血液学应用:DNA倍体分析及细胞周期分析编辑本段回目录

 
    在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性变化,正常情况下,大多数细胞处于休止期(Go), G1期细胞虽有DNA合成,但DNA含量仍为2N,为二倍体细胞,;处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞DNA含量为2N-4N;正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的DNA(4N)。细胞经固定后用PI(Propidium  Iodine 碘化丙啶)等荧光染料染色即可上机测定。但标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰。FCM可在测量大量细胞(数分钟可测定105个细胞)后给出DNA分布直方图。
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血液学应用:淋巴细胞亚群测定编辑本段回目录


淋巴细胞担负着免疫的主要功能。淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。临床经常测定的淋巴细胞亚群包括T淋巴细胞 (CD3+), T 辅助细胞 (CD3+CD4+), T 抑制细胞(CD3+CD8+), B 淋巴细胞(CD19+或CD20+),NK 细胞 (CD3-CD56+)等。
常用来测定淋巴细胞亚群的单克隆抗体(Monoclonal  Antibody McAb)都是小鼠抗人Ig,有精制抗体,有直标荧光抗体,现在一些国外公司有双色和三色McAb出售,如CD4-FITC/CD8-RD1、CD3-CY5/CD4-FITC/CD8-PE等,此时应根据这些双色或三色McAb的Ig性质选择相应的阴性对照,如MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC等。上机测定时应先测定阴性对照管,阴性对照的阳性细胞应<2.0%。
三色测定可给出更为准确的各亚群的情况:如真正的T 辅助细胞应是 CD3+CD4+CD8-, 真正的T 抑制细胞应是 CD3+CD4-CD8+,单标CD8+细胞中不仅有T 抑制细胞,还含有30%左右的NK细胞;而CD3+CD4-CD8-细胞群是γδT细胞,此类细胞与感染有关, CD3+CD4+CD8-细胞+CD3+CD4-CD8+细胞+CD3+CD4-CD8-细胞+CD3+CD4+CD8+细胞=CD3+细胞。如单标记CD56不能准确测定NK 细胞,NK 细胞应是 (CD3-CD56+),因为CD56+细胞中包含着非HLA束缚细胞毒T 细胞(CD3+CD56+)。双色组合还能测定B 淋巴细胞(CD3-CD19+或CD20+)、激活的T 细胞(CD3+CD69+或CD3+25+)等。
应用适当的双色组合如CD4与CD29,CD4与CD45RA,可以测定T辅助细胞的的亚群。如CD4+2H4(CD45RA)+细胞是Ts的诱导细胞;CD4+4B4(CD29)+细胞Th的诱导细胞。同理,利用CD8+CD45RA和CD8+CD29+S6F1可测定T抑制细胞的亚群。
T辅助细胞还可分成Th1、Th2两个亚群,同时标记细胞内细胞因子IFN-γ和IL-4,可区分Th1细胞(CD4+/ IFN-γ+)和Th2细胞(CD4+/ IL-4+)。
利用CD25、CD69等McAb和其他淋巴细胞标记双色或三色标记还可测定淋巴细胞亚群的功能状态,如活化T8、活化B细胞等。
    以下给出常用细胞亚群的正常范围供参考,请注意同一CD中有多种克隆的McAb, 同一CD中不同McAb所测出的数值不同,每个实验室应测定自己实验室的正常数值。
CD3+ 70.0±12.0% +4B4+ 23.0±7.0%
CD3+CD4+CD8- 40.0±9.0% CD4+2H4+ 19.0±6.0%
CD3+CD4-CD8+ 30.0±8.0%
CD3-CD56+(NK) 12.0±8.0%
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血液学应用:白血病免疫分型原理编辑本段回目录

 
    白血病免疫学分型是利用单克隆抗体(McAb)检测白血病细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型,以了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。对白血病细胞抗原的分析研究有助于对白血病分型,为诊断和治疗提供依据。白血病免疫分型是形态学分型的重要补充和进一步深化,国际MIC分型协作组认为每一例急性白血病的免疫分型都是必不可少的。白血病免疫分型对鉴别急淋和急非淋有决定作用,对鉴别急非淋的某些亚型如M7、M3也有决定作用,对于一些用形态学、细胞组织化学不能诊断的急性白血病,急性未分化白血病,混杂性白血病等有重要意义。自从单克隆抗体问世以来,最成功的应用就是研究造血系统各类细胞表面抗原与细胞增殖、分化及恶变的关系。研究发现细胞表面抗原有重要功能,一些抗原分子作为细胞生长因子的受体而影响细胞的增殖分化;一些抗原分子作为细胞间相互识别的物质基础而参与细胞间相互作用;一些抗原分子则是细胞特异功能的物质基础。
    从多能造血干细胞(PHSC)分化成熟为功能细胞过程中, 细胞表面和细胞浆内抗原随着分化成熟过程不断发生改变, 这些抗原称为造血细胞分化抗原。造血细胞分化抗原是造血细胞分化过程中由细胞核内染色体上的基因编码的镶嵌蛋白, 其出现、增多、减少或消失与造血细胞分化密切相而表现出与细胞系列及分化程度相关的特异性。这些抗原可作为鉴别和分类造血细胞的标记。如髓系细胞的MPO、CD33、CD13、CD14、CD15等抗原;巨核系的CD41、CD41、CD61抗原; T淋巴细胞的CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等抗原;B淋巴细胞的CD19、CD20、CD22等抗原。至今尚未发现白血病细胞特异性抗原,而白血病细胞是造血细胞在某一分化阶段的大量积累,表达与之相应的造血细胞分化抗原,因此可用造血细胞分化抗原类标记检测白血病细胞; 但白血病细胞毕竟不是正常造血细胞,其抗原表达与正常造血细胞并不完全相同。常有丢失某一分化发育阶段正常应有的抗原,或表达某一分化发育阶段正常不应有的抗原,或表达其他系列抗原,部分丧失了系列专一性和分化的严格性。
用FCM检测白血病免疫分型具有快速、简便、重复性好等优点。由于FCM可根据FSCνSSC直方图区分细胞并可圈定检测细胞范围(Bitmap,无定型门),或用SSC(线性或对数)和CD45直方图圈定检测细胞范围(Bitmap,无定型门),排除其他细胞干扰,因此较光学显微镜免疫荧光法或免疫组化法结果更准确。
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血液学应用: 白血病免疫分型其临床意义编辑本段回目录


     目前公认的系列特异性指标是:T淋巴细胞系--胞浆CD3(cCD3),B淋巴细胞系-- cCD22或cCD79,髓系---MPO 或cCD13,一般可先用他们区分细胞系列后再进一步分析某一系列亚型和分化阶段。
1. ALL的免疫学分型
1986年前分为普通型ALL(cALL)、未分化细胞ALL (Null-ALL)、T细胞ALL( T-ALL) 、前B细胞ALL (PreB-ALL)、B细胞ALL (B-ALL)五型;1986-1994年分为两大类九型(非T-ALL六型,T-ALL三型),九十年代后期有人按临床实用性一般分为B祖细胞ALL、前B细胞ALL、B细胞ALL、T细胞ALL四型。
B-祖细胞 ALL :B-祖细胞ALL 占儿童ALL的65%-70%,青少年ALL的55%-60%,成人ALL的50%,儿童ALL >90%病例 CD10+,而婴儿CD10+病例<50%。FAB分类为L1、L2,白血病细胞的FS和SS都很低;一般TdT、HLA-DR、CD19阳性,大多数病例CD24、CD34阳性,本型细胞膜免疫球蛋白(Ig)阴性。此型有CD10+、CD10-两个亚型,CD10+型预后较CD10-型好。
前B 细胞ALL :前B 细胞ALL在发育阶段上较B祖细胞 ALL晚,占儿童ALL的25%,在成人ALL占的比例还不清楚。一般CD24、HLA-DR、CD19、 CD10、cCD22阳性,CD34阴性,鉴别特点时有胞浆重链μ。此型预后较B祖细胞ALL差,可能与t(1;19)有关,t(1;19)占前B 细胞ALL的25%,此型CD34-,而B系列ALL中CD34-是独立的预后不良标记。
B细胞ALL :B细胞ALL 占所有ALL 的2%-5%;B细胞ALL更为成熟,白血病细胞的FS和SS较B-祖细胞 ALL明显增加,在FSνSS直方图或SS(线性或对数)νCD45直方图中处于淋巴细胞和单核细胞区域。典型标记是细胞膜免疫球蛋白(sIg)阳性,表型一般为CD19、CD20、CD22、CD24阳性,多数病例CD10+,但sIg和成熟抗原出现可区别于更早的B系ALL。此型FAB分类一般为 L3,罕见病例有B细胞ALL标记而FAB分类一般为 L1,这些病人多有t(1;19)和t(14;18)。
T细胞ALL :T细胞ALL占儿童ALL的15%,成人ALL的25%。多数表型为胸腺细胞型,最常见的是晚期胸腺皮质细胞亚型,CD1+、CD2+、CD5+、CD7+,CD4+CD8+,CD3表达较少,TdT常阳性;另一常见亚型是早期胸腺皮质细胞亚型,CD2+、CD5+、CD7+、TdT+。髓质期亚型较少见,CD2+、CD5+、CD7+,CD3+CD4+或CD3+CD8+,TdT表达较少。前T细胞亚型,仅有CD7和cCD3而无其他T系抗原表达,预后较差。T系肿瘤性疾病多有特异性正常抗原表达的下调或表达该分化阶段正常不应出现的抗原。成人T细胞ALL预后较好,而儿童T细胞ALL较儿童B-祖细胞 ALL和前B细胞 ALL预后差,虽然各亚类预后仍不甚明确,但CD10阴性者预后不良。
    ALL 的免疫学分型经过1986年前分为五型,1986-1994年分为两大类九型,九十年代后期(1997)分为四型的过程。1986年前的五型,是当时单克隆抗体和检测手段的反映;随着新的单克隆抗体(主要是T、B淋巴细胞亚群的McAb)的发现和临床大量病例的检测,不仅弄清了T、B淋巴细胞的来源、分化发育过程,而且使免疫分型更加细致,因而出现了1986-1994年分为两大类九型;但按照细胞的分化发育阶段分型的两大类九型分型法对临床略显繁琐,指导治疗、判断预后临床实用性也不够强,因此又出现了以上简单的四型分类法。经过对比不难看出,四型分类法的B-祖细胞ALL型实际上包含了两大类九型分类法的非T-ALL的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3个亚型,而Ⅴ型即是前B 细胞ALL型,Ⅵ型是B 细胞ALL型;而T细胞ALL型是两大类九型中T-ALL的三型合并为一型。两大类九型分类法的非T-ALL的Ⅰ型分类为急性未分化白血病(见后)。
ALL也可按DNA含量分类,用流式细胞仪很容易测定DNA含量,DNA含量分为两个亚类:超二倍体和亚二倍体,前者预后好,后者预后差。
2.急性髓细胞白血病(AML)攪
目前所有粒、单核系的单克隆抗体基本无分化发育阶段特异性,因此AML的免疫学分型FAB-M0、M1、M2界限不十分明显;但M3多不表达HLA-DR和CD34,常表达CD13、CD33、CD9、CD38;GPA在鉴别红白血病(M6)时可提供帮助;巨核细胞白血病(M7)则有CD41、CD42、CD61为系列特异标记,为确诊的重要指标。由于白血病的异质性,同一FAB分类的白血病抗原表达并不完全相同。
M0:M0白血病细胞的FS和SS都很低,在SSνCD45直方图中处于原始淋巴细胞区域。M0的白血病细胞至少表达一个髓系特异性标记如MPO、CD13、CD116,MPO较CD13、CD116更敏感;一般淋巴系标记是阴性的,但可能表达CD7或CD4;一般CD34、HLA-DR阳性。有研究显示AML复合表达CD7和CD34预后不良。
M1:M1的白血病细胞抗原表达类似于M0并与M0不好区分,M1一般表达CD13,CD33和HLA-DR,CD34表达较M0少,部分可能表达CD15,较少病人可能表达CD4。
M2:M2与M1的主要区别是分化成熟增加,原始细胞减少;CD34表达较M1少,CD15表达较M1增加,大部分病例HLA-DR阳性,CD13表达强于CD33;部分M2表达CD19和CD56伴有t(8;21),罕见的伴有t(8;21)的M2不表达CD13,CD33和CD14但MPO阳性。
M3:M3白血病细胞由于它的高颗粒性而SS增大;M3的白血病细胞一般表达CD13,CD33,部分病人可能表达CD2,但HLA-DR阴性,CD34一般为阴性,复发病人阳性;部分病人可能表达CD56,表达CD56者应作基因检查(APL/RARα)以排外髓/NK细胞急性白血病(详见后)。
M4、M5:M4、M5的免疫表型相似,重要表型特点是表达CD13、CD33、CD14、CD15和HLA-DR,部分病人表达CD4、CD7,部分病人可能表达CD56,表达CD2多为M4E0,常伴有16号染色体异常,预后好。
M6:M6较少见,一般表达HLA-DR、CD34、CD13、CD33,GPA对确定红系有用。
M7:M7占成人ANLL的1%、儿童的4%。成人M7多见于二次性白血病,即CML.BC或MDS-RAEB或MF白血病变。而儿童M7多为原发。M7免疫学表型一般为:CD41+,CD42+,CD61+,CD33+/-,CD13+/-,CD34+,DR+/-,CD10-。特异性标记CD41、CD42、CD61阳性可确诊M7,但要注意排外血小板粘附于细胞上的假阳性结果。
3.急性未分化白血病  用流式细胞仪分析仅有大约1%的急性白血病不能分类,典型急性未分化白血病仅有HLA-DR和CD34表达而无系列特异性抗原表达。
4.杂合型白血病   真正的双系列表型白血病是伴有t(9;22)或有11q23 MLL(myeloid/lymphoid or mixed lineage leukemia髓/淋系或混合性白血病)基因重排的病人,以往报道的许多杂合型白血病多是由于方法学问题不能排除非白血病细胞的干扰,或将非特异弱表达当作特异表达,如前所述白血病细胞毕竟不是正常造血细胞,其抗原表达与正常造血细胞并不完全相同,部分丧失了系列专一性和分化的严格性,因此不要轻易定型杂合型白血病,国际上杂合型白血病尚无统一诊断标准。
5.慢性粒细胞白血病急性变(CML BC)   慢性粒细胞白血病(慢粒 CML)是一种多能造血干细胞疾病,其转归多为急性变。慢粒急变(CML BC)涉及所有造血细胞系列,往往不易从形态学上确定急变类型, 50%-60%为AML变,30%左右为ALL变。AML变可表达AML的所有表型,大多数ALL变为B细胞来源,其中cALL及前B-ALL多见,罕见T-ALL变。 
6.B 淋巴系细胞增殖性疾病
     B 淋巴系细胞增殖性疾病中包括B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B幼淋细胞白血病(B-PLL)、毛细胞白血病(HCL)和多发性骨髓瘤(MM)/浆细胞白血病和部分淋巴瘤,淋巴瘤免疫分型将在不同章节中描述。
B-CLL:B-CLL的白血病细胞一般表达CD19、CD20、CD43和CD79a,CD5与以上抗原复合表达,sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表达但表达较弱,CD10、CD22阴性。伴染色体异常者预后较差。
B-PLL :流式细胞仪在区分B-PLL和B-CLL中十分有用, B-PLL通常sIg表达强, CD5阴性而CD22阳性,困难的是原发B-PLL和由B-CLL转化为B-PLL的区分, 由B-CLL转化来的B-PLL CD5阳性而CD22表达弱,类似于B-CLL。
HCL:HCL 一般表达成熟B细胞标记:CD20、CD22、CD19、CD79、sIg,CD11c、CD22高表达,CD25中等度以上表达,一般CD21-,典型病例CD5-、CD10-、CD23-,但有少数病例可阳性。CD103是HCL最可信的标记,可用来与其它B细胞白血病鉴别。
浆细胞瘤:由于大多数多发性骨髓瘤病人骨髓标本中含骨髓瘤细胞少及瘤细胞丧失了大多数B细胞系特异性标记,用流式细胞仪分析多发性骨髓瘤(MM)/浆细胞白血病较为困难,典型的浆细胞CD38强表达而CD45弱表达。一般浆细胞sIg弱表达,cIg阳性。
7.T淋巴系细胞增殖性疾病
T淋巴系细胞增殖性疾病中包括T幼淋细胞白血病(T -PLL)、NK细胞白血病(T-LGL、NK-LGL)和成人T淋巴细胞白血病(ATL)、T慢性淋巴细胞白血病(T-CLL)。
T-PLL :T-PLL的白血病细胞一般表达CD2、CD3、CD5和CD7,大多数病人CD4+ CD8-,但偶有CD4+ CD8+,单独表达CD8者少见, 本病常伴有14q11和14q32改变, 有CD4+ CD8-表型者预后较好,本病较B-PLL恶性度高。
NK 细胞白血病 :NK系列白血病最早描述的是大颗粒淋巴细胞白血病(LGL), LGL有两种类型:T-LGL和NK-LGL,T-LGL表达CD3、CD8、CD2、CD16、CD11b、CD57、而CD56、CD5、CD7、CD4和CD25多阴性,有TCR基因重排。NK-LGL表达CD2、CD16和CD56,而CD3、CD4多阴性,CD8、和CD57弱表达或阴性,无TCRα-β基因重排。最近NK系列白血病又有新的亚型发现,如急性前髓系/NK 细胞白血病、急性髓系/NK 细胞白血病、原始NK 细胞白血病、NK样T细胞白血病。急性前髓系/NK 细胞白血病是一种最近认识的不同类型的白血病, 其特点是有明显髓外涉及,不成熟的原始淋巴细胞样形态,伴MPO--、CD7+、 CD33+/CD13+、sCD3-、cCD3-、CD56+,预后不良。急性髓系/NK 细胞白血病,形态学和免疫表型类似于M3,但无RARα基因重排,一般HLA-DR-、CD33+、CD13+、CD56+,多见于老年病人,对维甲酸无反应。原始NK 细胞白血病,无髓系和淋巴系抗原,CD56+、cCD3+/-、CD2+/-、CD4+/-、CD7+/-,少数有TCRβ基因重排,而无TCRγ-δ基因重排。NK细胞系列白血病的新亚型是近10年才较多注意到的白血病,其临床特点,免疫表型,染色体及基因改变需进一步积累病例研究才能彻底明了。大约10%-20%左右的急性白血病表达CD56,除了原始NK 细胞白血病、NK样T细胞白血病、急性髓系/NK 细胞白血病、急性前髓系/NK 细胞白血病外,大部分表达CD56的急性白血病是FAB分类的M2、M3、M4、M5型,这类病人究竟是急性髓系/NK 细胞白血病还是急性髓系细胞白血病伴NK抗原表达有待进一步研究,鉴于急性白血病部分丧失了系列专一性和分化的严格性,可能称为急性髓系细胞白血病伴NK细胞抗原表达较为合适。
成人T淋巴细胞白血病(ATL):大多数ATL细胞表达激活T细胞表型:CD3、CD4、CD5、CD25、HLA-DR、TCR,一般CD7-和CD8-,常有粘附分子L-选择素的异常表达; 伴有p53异常者预后不良。
T-CLL:T-CLL少于CLL总数的1%,细胞形态学类似与一般CLL,但临床发展较快,但多数病人表达CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、少数病人表达CD8。
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血液学应用:淋巴瘤免疫分型编辑本段回目录

 
    目前淋巴瘤的分类方法已从LSG的形态学分类逐渐转变为REAL分类法, REAL分类法是以肿瘤发生源为基础的分类方法,在原来的形态学基础上加上免疫学分型后再加以分类,这种分类方法不仅能够推断肿瘤的发生源,对治疗也有指导意义。因此淋巴瘤的免疫分型越来越重要。如同白血病免疫分型一样,淋巴瘤的免疫分型也是利用单克隆抗体检测淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型,以了解被测淋巴瘤细胞所属细胞系列及其分化程度。流式细胞仪能对多数的淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原迅速客观地做出检测,在淋巴瘤的免疫分型中起着不可替代的作用。
临床淋巴瘤的免疫分型的检测标本一般是淋巴结、脾脏、胸水、腹水等。在临床淋巴瘤的免疫分型工作中常可遇到以下四种情况:①B细胞系淋巴瘤②T/NK细胞系淋巴瘤③淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤④造血细胞以外的肿瘤。
1. B细胞系淋巴瘤    大多数情况下, B细胞系淋巴瘤CD19、CD20阳性,分化早期CD20阴性,CD10、CD34阳性;分化晚期CD5、CD23阳性,成熟为浆细胞后以上标记均阴性。利用单克隆抗体κ、λ(正常时κ:λ=2:1)可检测免疫球蛋白轻链的偏移,推断是否克隆性增殖免疫球蛋白。表12.6. 列出了外周B 淋巴系淋巴瘤的4种类型的免疫分型。
SLL(small cell lymphocyte lymphoma)--小细胞淋巴细胞淋巴瘤: 小细胞淋巴细胞淋巴瘤细胞一般表达CD19、CD20、CD43和CD79,CD5与以上抗原复合表达,sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表达但表达较弱,CD10、CD22阴性。伴染色体异常者预后较差。
MCL(mantle cell lymphoma)--斗篷细胞淋巴瘤:MCL包括以前分类为中等淋巴细胞淋巴瘤(ILL)、中度分化淋巴细胞淋巴瘤(IDL)、中心细胞淋巴瘤和套区细胞淋巴瘤(MZL),占淋巴瘤的2%-8%,λ型较κ型常见, sIgM中度表达,IgD弱或阴性,表达CD19、CD20、CD22、CD43,但多数病例CD5阳性CD23阴性,CD10一般阴性,CD5阳性CD23阴性和Ig类型可帮助鉴别MCL和FCL。
FCL(Follicular center cell lymphoma)---泸泡中心细胞淋巴瘤:FCL占淋巴瘤的45%,表达CD19、CD20、CD22, sIg强表达,但多数病例CD10和CD23阳性,典型FCCL CD5、CD43和CD11c阴性。CD10阳性、CD11c阴性和sIg强表达利于与MZL鉴别。
MZL(Marginal zone lymphoma)--边缘带淋巴瘤和相关B 细胞淋巴瘤:典型免疫表型: CD19、CD20、CD22、HLA-DR阳性,sIg中度表达,CD5、CD10、CD23、CD25阴性,CD21、CD24多数情况下阴性,多数表达CD11c。CD5、CD10、CD23、CD25阴性,CD21、CD24多数情况下阴性,利于与CLL/SLL、FCCL、MZL鉴别。
2. T/NK细胞系淋巴瘤   早期T细胞一般CD2、CD5、CD7、cCD3阳性。T/NK细胞系淋巴瘤的详细分类及表型参见表12.8。细胞膜CD3阳性可确认为外周T细胞肿瘤, 外周T细胞肿瘤的特征是CD3与CD4或CD8复合表达,并常有克隆性T细胞受体,或α-β型或γ-δ型;
MF(mycosis fungoides)--蕈样真菌病和sezary综合症:占皮肤淋巴瘤的绝大多数,CD4阳性,同时表达CD2、CD3、CD5,有时CD7阴性,CD8阳性病例极少见但已有报道,有无TCRβ基因重排对鉴别淋巴瘤和炎性反应有帮助。
LCL(large cell lymphoma)--大细胞淋巴瘤: 大细胞淋巴瘤(LCL)占成人淋巴瘤的40%,儿童的1/3,成人80%是B细胞型的,儿童B细胞型和T细胞型各占一半。
3. 淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤  急性髓系细胞白血病(特别是M4、M5)淋巴结转移时有发生,如T、B淋巴细胞标记低表达应怀疑并按白血病免疫分型处理。
4. 造血细胞以外的肿瘤  检测淋巴结、胸腹水标本时如遇CD45阴性情况应考虑非造血系统肿瘤淋巴结、胸膜、腹膜转移。
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血液学应用: 红细胞疾病诊断编辑本段回目录


(一)网织红细胞测定
    计数外周血中网织红细胞数量,对于评价骨髓红系造血及网织红细胞从骨髓到外周血的转送速率有重要意义。有核红细胞在成熟过程中,脱去细胞核后仍有少量RNA残留在细胞浆内,再经过约一天时间残留RNA完全消失,成为成熟红细胞。这种细胞浆内有残留RNA的红细胞称作网织红细胞。正常情况下有一定量的网织红细胞出现在外周血中,正常值为1.0~1.5%,上限3.0%,但当红细胞数异常时会出现错误结果。因此用网织红细胞绝对值表示,正常值5~15×1010/L。由于常规方法测定须先在体外经活体染色(最常用亚甲兰),然后在显微镜下计数,计数细胞数有限。用流式细胞仪测定网织红细胞具有以下优点:①可避免由于细胞核的碎片或铁幼粒细胞的颗粒的存在而出现假性网织红细胞升高②可避免人为误差③因为可在短时间内测量上万个细胞,结果较常规方法准确、可靠,④同时可给出网织红细胞年龄结构。
流式细胞仪测定网织红细胞方法简单,只须将红细胞洗净后用荧光染料染色后即可上机检测。常用的荧光染料有焦宁Y(Pyronin Y) 丫啶橙(Acridine OrangeAO) 碘化丙啶(崐Propidium Iodine PI) 花青( Cyanine dye)等。
(二)PNH诊断
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)因血细胞膜上锚固蛋白-糖磷酸肌醇(GPI)减少或缺乏而导致与GPI有关的补体激活抑制因子如CD55、CD59减少或缺乏,因而红细胞对补体异常敏感发生溶血。流式细胞仪检查CD55、CD59十分敏感,正常人CD55、CD59双阳性细胞>95%,PNH病人CD55、CD59明显减少,这种减少不仅表现在红细胞上,粒细胞、淋巴细胞也有减少。已发现CD55c可能对GPI减少或缺乏较CD59更敏感。
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血液学应用: 血小板功能分析和血小板病诊断编辑本段回目录


(一) 血小板功能分析
   血小板膜上有丰富的糖蛋白受体,是血小板发挥其功能的物质基础,静止期和活化期血小板的膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同,用不同的抗血小板单克隆抗体可测定和分析血小板功能状态。血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b (GPIb)、CD41b (GPIIb)、血小板颗粒膜糖蛋白CD62p、CD63的测定可供分析血小板功能状态,如CD62p、CD63正常血小板不表达,当血小板活化时表达明显增加,可用来测定活化血小板。
(二)血小板病诊断攪
1.血小板相关抗体测定   血小板相关抗体可因不同机制产生。抗血小板自身抗体(包括原发性、药物诱导产生、合并其它自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮)能引起严重的血小板减少。大多数原发性(免疫性)血小板减少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相关抗体PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小板相关抗体的抗原仍不十分清楚,可能有多种,如GPⅠb、GPⅡb 、GPⅢa、Pa、或HLA抗原。抗血小板自身抗体也可能发生于多次输血后或怀孕期间,这些自身抗体多为针对HLA-Ⅰ类抗原决定簇的抗体,一般是IgG,它们可迅速破坏和清除随机供血者的血小板。因此能迅速测定这些抗体存在与否的方法是必需的。许多不同的利用放免、荧光、酶、SPA等的测定血小板抗体的方法已建立,但这些方法都很复杂、费时;同时给出的结果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗体来表示。近年来发展起来的用FCM测定血小板抗体的方法具有快速、简便的优点,同时可测定血小板上和血清中的抗体;测定中FCM分析每一个血小板表面有无抗体,能给出血小板群体中有多少血小板表面有抗体(以%表示);同时能给出血小板相关抗体量与血小板数的直方图,使我们了解血小板相关抗体在血小板群体中的分布情况。
FCM测定血小板抗体原理:分别用标有荧光的抗人IgG、IgA、IgM或用抗血小板GPⅠb、Ⅱb、Ⅱb/Ⅲa的抗体与分离洗净的病人的血小板和在病人血清中孵育过的正常O型血小板作用后用FCM测定,前者测定的是病人血小板上的抗体后者测定的是病人血清中的抗体。
2.血小板无力症   血小板无力症时血小板膜GPIIb/IIIa明显减少,用血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41、CD61和流式细胞仪测定不仅可测出GPIIb/IIIa减少,CD42a、CD42b基本正常或偏高,还可测出GPIIb/IIIa减少程度,分类血小板无力症。
3.巨大血小板综合征(BSS):血小板巨大, CD42a减少,CD42b减少,CD61 增加。
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血液学应用:微小残留白血病检测编辑本段回目录

    微小残留白血病(Minimal Residual Leukemia MRL)是指白血病经治疗后获得完全缓解(Complete Remisson CR)后体内残留少量白血病细胞的状态。微小残留白血病与明显白血病(Overt leukemia)无明确界限,仅是白血病细胞负荷数量不同,一般成人明显白血病时白血病细胞可达1012,经治疗获CR后≤1010,因此MRL状态白血病细胞数可能是100-10攪。MRL是白血病复发的根源,因此检测MRL有十分重要的意义: ①指导临床治疗②预测白血病复发③评价自体骨髓移植的净化效果。应用FCM检测MRL的优点在于可在短时间内分析大量标本,具有快速的特点。
    由于白血病细胞缺乏特异性标记,FCM检测MRL的效果尚不理想,敏感性尚不够高,一般仅有1/103-104。目前主要有两类检测方法: ①用FCM分析CR期骨髓细胞核酸量或染色体,可用于部分AL病人MRL分析,但敏感性仅1-5%。②免疫表型分析,由于尚无白血病特异的标记,只能通过与正常细胞比较某些抗原量的差别及分布部位的不同作为检测依据;如利用TdT和CD10双标记检测MRL,但敏感性亦不高,约0.1-1%。  
假阴性结果可能由于: ①标本中的白血病细胞<10-4攪或<10-5;②所取标本不能代表全身骨髓情况; ③病人白血病细胞表型转换。
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血液学应用:白细胞吞噬功能测定编辑本段回目录

      粒、单核-巨噬细胞是机体免疫反应和免疫调节细胞中的重要成员。它们不仅具有吞噬功能,吞噬外来的微生物、肿瘤细胞等,同时又分泌多种生物因子参于免疫反应,此外单核-巨噬细胞对抗原物质的摄取、修饰、递呈等作用,是淋巴细胞的免疫功能必不可少的。因此检测白细胞吞噬功能对了解机体免疫状况有重要意义。以下简要介绍FCM测定白细胞吞噬功能的概况。
    应用光学显微镜、荧光显微镜测定白细胞吞噬功能时须分离粒、单核细胞, 并尽可能地保持细胞活性。用FCM检测时不须分离细胞,应用全血即可, 因此可在自然状态下测定,结果准确可靠。
    目标粒子一般以酵母、细菌等能激发自然吞噬作用或予先以抗体调理化的人造粒子为好;并标以荧光,常用者为FITC(异硫氰酸荧光素)或RA(罗达明).
    以肝素或拘橼酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200μl全血与目标粒子200μl(目标粒子浓度4×107/ml)置37°C温育,温育结束后立即置冰水中, 以同样标本不在37°C温育而置于冰水中者作为对照。目标粒子不同温育时间不一,FITC标记的金黄色葡萄球菌25分钟,FITC标记的粒子15分钟即可达到吞噬饱和;此外,粒子与白细胞的比例也很重要,一般为10:1。温育结束后以溶血剂溶去红细胞即可上机检测。
      应用FCM全血法测定白细胞吞噬功能,对白细胞的丢失、损伤最小;此外用本法可测定血清中的调理素(Opsonine)水平及血清中有无吞噬作用抑制因子。如果用FITC标记的单克隆抗体 CD13、CD14、CD15标记粒、单核细胞,用红荧光标记目标粒子,即可测定吞噬功能与细胞表面标记的关系,对白细胞吞噬功能作进一步的研究。
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血液学应用:NK和LAK细胞活性测定编辑本段回目录

      NK细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无MHC限制性,它们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标。人NK细胞一般表达CD56、CD16、CD57部分表达CD2、CD8、CD11而不表达CD3。
    LAK(Lymphokine Activated Killer cells)细胞主要存在于LGL的高密度群体中,LAK前体细胞表达NK细胞标志CD16而不表达T细胞标志如CD3、CD4、CD5等;它们不需要抗原刺激就能杀伤NK细胞不能杀伤的肿瘤细胞,并且无MHC限制性;从表型上看大多数LAK细胞来自NK细胞,但严格讲LAK细胞对K562细胞的杀伤活性不能称作LAK活性,测定LAK活性的靶细胞应为NK抵抗的实体瘤细胞,如HL-60细胞、HeLa细胞等。
   常用的测定NK和LAK细胞活性的方法较多,如攩51Cr释放法、[3H]TdR参入法或释放法、LDH释放法、ATP发光法等;应用放射性同位素对人体和环境不利,利用FCM测定NK和LAK细胞活性从1986年就开始摸索,方法已趋于成熟,以下介绍其中一种:
肝素抗凝取外周血后分离PBMC后洗净,调整细胞浓度为106/ml,为效应细胞;靶细胞分别为K562和HL-60或HeLa细胞,在对数生长期受集细胞,调整浓度为106。用3mMDiO(3,3-Diacradecyloxacarbocyanine Perchlorate)标记靶细胞,效应细胞:靶细胞(E:T)为40:1、20:1、10:1和5:1,孵育后加入PI(10μg/ml)染死细胞,洗净后即可上机检测。DiO发绿荧光,PI发红荧光,利用双参数(FL1vFL2)直方图可清楚地了解靶细胞中的死亡细胞,计算出靶细胞%溶解率。
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血液学应用:造血干/祖细胞测定编辑本段回目录

      造血干/祖细胞移植已广泛应用于血液肿瘤、实体瘤、某些遗传性疾病、免疫缺陷病等,因此检测造血干/祖细胞已成为临床必不可少的手段。应用流式细胞仪多色技术测定外周血造血干/祖细胞,具有快速、准确的优点,不仅能确定造血细胞数量,而且能对造血干祖细胞的质量进行评价,为临床干细胞移植治疗提供重要数据。目前多色组合一般包括CD34、CD38、HLA-DR等McAb。
    CD34抗原是一种分子量约11万的糖蛋白,选择性地表达于早期造血干/祖细胞、小血管内皮细胞和胚胎纤维母细胞表面。该抗原在原始造血细胞上表达,以后随细胞分化、成熟逐渐减少直至消失,因此一直作为造血干/祖细胞表面的一种特征性标志而广泛应用于造血干细胞基础研究和临床。CD34+细胞是一群不均一的群体,依其是否表达CD38、HLA-DR、CD33、c-kit等分出的亚群表现出了不同的造血性能。最近随着造血理论的深入研究关于造血干细胞究竟是否都是CD34+细胞出现一些争论,实验研究证明, CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞更具造血潜能,有人经实验研究提出CD34的表达与造血干细胞的细胞动力学相关,细胞激活时CD34+,细胞处于稳定状态时CD34-;也有人提出CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞发育阶段更早。我们认为:成人体内可能仍保留着一小部分原始间充质细胞,他们仍保留着多向分化能力,也能向造血干细胞分化,因此体内有CD34-造血干细胞和CD34+造血干细胞是正常的,CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞发育阶段更早、更具造血潜能;但目前的用CD34+细胞代表造血干细胞的检查方法已足以满足临床需要,因为临床实践已证明这一点。理论研究往往能推动学术发展,开发新技术,我们期待着造血理论的不断发展给临床带来新技术,不断提高临床疗效。
    我们用CD34、CD38、HLA-DR三色组合测定了151份外周血经动员后标本,CD34+细胞占单个核细胞(MNC)的(0.954±0.466)%,含量为(3.55±2.41)×109/L;其中CD34+CD38-亚群含量为(0.253±0.24)×109/L,占CD34+细胞的7.13%;CD34+HLA-DR-亚群含量为(0.273±0.310)×109/L,占CD34+细胞的7.61%;随着采集次数的增加,CD34+细胞及其亚群数量逐渐减少(P<0.05);随着供者年龄增加,其外周血CD34+细胞数逐渐减少,在≥40岁供者CD34+细胞百分比和含量比<20岁供者分别降低了47%和50%;动员后外周血CD34+细胞数存在性别差异,男性供者外周血CD34+细胞数较女性高23%。
      应用流式细胞仪测定造血干细胞虽具有快速、准确的特点,目前被广泛采用。但应用中要特别重视质量控制,要建立一套完整质控方法以确保检测的准确性。

其他应用编辑本段回目录

流式细胞仪可能在两方面对骨髓增生异常综合症(MDS)有用,一是测定CD34阳性细胞数,以监测病情,二是测定核蛋白增殖因子(PCNA),有报告PCNA再在生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症、白血病三种疾病中表达有明显差异,可辅助鉴别诊断。
    此外流式细胞仪也可检耐药蛋白,如肺耐药相关蛋白(LRP)、多药耐药蛋白(MRP)、 P170等。
    流式细胞仪也可检测细胞因子,细胞内细胞因子如白介素系列(IL-1—IL-14),肿瘤坏死因子(TNF),干扰素(IFN)等,只要用适当的打孔剂即可用抗上述细胞因子单克隆抗体标记后用流式细胞仪测定。

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