流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度>95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器,已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断,对淋巴细胞群和亚群进行精确分类,还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备,染色后也能在荧光显微镜下进行观察,在某些实验条件下,活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
流式细胞仪技术,主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光,经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点,当每个细胞经过焦点时,发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置),光检测器把散射光定量转化成电信号,经数字转换器进行数字化后而成整数,然后进行电子存储,以后数据可以调出显示和进行分析。其优点如下:
1、具有操作简便,只要将染色的单个细胞推入仪器中,就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度,而且每次可测出许多数据,一般情况下,每秒可测5000个细胞,能迅速分析和记数大量细胞,并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛,即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析,也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群,既可测定DNA和RNA、测凋亡峰,又可测蛋白含量,特别是胞浆蛋白。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型(又称小型机、台式机)和综合型(又称大型机、分析型)。ECKMAN-COULTER公司的产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL等, B-D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型,除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,多用于科学研究。
流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。
主要技术指标
1.流式细胞仪的分析速度:
一般流式细胞仪每秒检测1000~ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度:一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差>5%即可区分。
3.前向角散射(FSC)光检测灵敏度:前向角散射(FSC)反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm~0.5μm。
4.流式细胞仪的分辨率:通常用变异系数CV值来表示,,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
5.流式细胞仪的分选速度:一般流式细胞仪分选速度>1000个/秒,分选细胞纯度可达99%以上。
主要构造和工作原理:流动室及液流驱动系统 编辑本段回目录流动室(Flow Cell或Flow Chamber)是流式细胞仪的核心部件,流动室由石英玻璃制成,单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光垂直相交,在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动,控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成,只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向,能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而使激光激发的荧光信息准确无误。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种,供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。
主要构造和工作原理:激光光源及光束形成系统
流式细胞仪可配备一根或多根激光管,常用的激光管是氩离子气体激光管,它的发射光波长488ηm,此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633ηm)和/或紫外激光管。
流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的,荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关,激光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照,正是能达到这一要求的理想的激发光光源。
在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜,将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μm×66μm),在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致。
主要构造和工作原理:光学系统
流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成,大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成,透镜和小孔(一般为2片透镜、1个小孔)的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束,使激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致,最大限度的减少杂散光的干扰;流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成,滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。滤光片主要有三类:长通滤片(LP)--只允许特定波长以上的光线通过,短通滤片(SP)-- 只允许特定波长以下的光线通过,带通滤片(BP)-- 只允许特定波长的光线通过,不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT),如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525, 接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575, 接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。
主要构造和工作原理:信号检测系统
当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射(Forward Scatter, FS)和侧向角散射或900散射(Side Scatter, SS),散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备(如染色)无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光,它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。
前向角散射(FS)反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号;侧向角散射或900散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。
流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm)。488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)、PI(碘化丙啶)、CY5(化青素)、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是:
激发光波长(ηm) 发射光峰值(ηm)
FITC 488 525(绿)
PE 488 575(橙红)
PI 488 630(橙红)
ECD 488 610(红)
CY5 488 675(深红)
PreCP 488 675(深红)
各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。
主要构造和工作原理:信号存储、显示、分析系统
(一) 信号存储
存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode(列表排队)方式存入的,采用List mode方式有两大优点:①节约内存和磁盘空间②易于加工处理分析。
(二)信号显示和分析
由于List mode方式数据缺乏直观性,数据的显示和分析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。
1.单参数数据显示和分析 细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显 示,图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值,其单位是道数,可以是线性的,也可以是对数的;纵坐标表示细胞数。一维直方图横坐标是FITC荧光信号相对强度值(对数),纵坐标表示细胞数;图中已根据阴性对照设定适当的“门”(直线门),仪器的计算机就会给出测定值(包括阳性细胞%和平均荧光强度)。
2.双参数数据显示和分析 细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。
3.三参数数据显示和分析 细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对(三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据)用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。三个荧光数据关系用分光图(prism)表示,分光图可直接给出8个数据(如用ABC代表3种荧光,可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-)。
主要构造和工作原理:细胞分选系统 编辑本段回目录 如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动,可带动细胞流动室高频震动,使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴, 每秒钟形成液滴上万个。每个液滴中包含着一个样品细胞,液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中,不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中,从而实现了分选。
活体流式细胞仪(In vivo Flow Cytometer, IVFC) 是一种新的生物医学光学仪器,结合活体(近红外)实时高速影像方法和体外流式细胞仪的概念,可实时检测活体CTC并可以进行定量分析与检/监测,可用于实验室对肿瘤治疗效果的早期实时监测及评估,药物的早期筛选等。
IVFC技术原理是:带有荧光标记的癌细胞在流动过程中经过放置于血管某处横截面的一束激光,其受激发射的荧光信号通过光电转换和模/数转换在计算机中储存,通过一段时间内检测荧光信号来实时记录循环系统中流过的癌细胞的数量。这种方法主要的特点是不用抽血,可在血管中检测,属于微创体内诊断方法。
浮游植物流式细胞仪利用流式细胞测量技术,在野外现场快速对水体中的浮游植物进行计数的仪器。与传统的生物医学流式细胞仪相比,具有如下显著特点。
1)细胞粒径范围大,可测量0.4 um-4000 um间的浮游植物,几乎覆盖自然界的所有浮游植物粒径范围
2)检测器强大,目前一台标准的浮游植物流式细胞仪CytoBuoy配备6种检测器:前向光散射(FSC)、侧向光散射(SSC)、红色荧光、绿色荧光、橙色荧光和曲度检测器。可以对浮游植物进行分类。
3)坚固、耐用、轻便,适合野外现场测量,而传统的流式细胞仪非常笨重,只能实验室内使用。
4)样品不需任何前处理,可以直接测量。传统的流式细胞仪前处理复杂,处理不好就会阻塞管路。
5)不需外加鞘液,仪器自动采用水样的滤液为鞘液,维护方便。
6)多版本可选。有便携式机型CytoSense、在线监测型CytoBuoy和水下型CytoSub。
7)可建立浮游植物专家库,可对自然界水样中的特点浮游植物(如易引发赤潮的硅藻和甲藻)鉴定到种,进行早期预警
8)新增成像功能,可拍摄特定细胞的显微照片。
一、样品的制备
流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号,因此,细胞必须做成单个细胞悬浮状态,不能聚集,也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异(如特异单抗),而且不允许渗透至载液中。
标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系,要经Ficoll分离,作单细胞分离处理,但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞,需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等),化学法(EDTA、EGTA和柠檬酸盐)消化分散液或洗液最好用无钙、镁PBS,柠檬酸盐的浓度为40μmol/L,并同时采用机械分散法,将经消化处理的膨松组织,用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可,用PBS洗2~3次后重悬,最好过一下尼龙或不锈钢网筛100μm和20μm。细胞浓度要保证在1-2×106/mL
若标本用于测定单个细胞,需加入1~5 mg/L的DNAase,将有助于阻止破碎细胞释放的DNA造成细胞再聚集,但是若分离的细胞要作DNA含量测定之用时,则切勿加DNAase。
二、悬浮细胞的固定
上述制备的活细胞即可用于流式细胞仪分析,如果染色和流式分析要拖后进行,或为了提高染色效果,则要将细胞预固定。乙醇固定是常用的方法。
1、固定方法:
(1)甲醛法:在细胞悬液中加入等量的8%甲醛(用Hank'S液配)4℃下固定12-18小时。
(2)乙醇法:细胞悬于PBS中,缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇,使终浓度为70%,冰浴30分钟。
(3)丙酮法:于细胞悬液中,缓慢加入冷丙酮,使终浓度为85%。
2、实例:
(1)用预冷的无钙、镁含0.5mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲液,将细胞制成1×106细胞的悬液。
(2)在4℃下逐滴加入3倍体积的95%乙醇,连续搅拌使乙醇终浓度达70%。
(3)该细胞可在4℃下保存数日。
(4)分析前先用1000r/min离心10分钟,弃去乙醇,再将细胞悬于PBS中或要求的试剂中。
三、流式细胞仪分析的应用
(一)非染色细胞的光散射
一个粒子(如细胞)出现在一束光线中,立即会干扰该光束,造成该光束入射光的重分布,该细胞所获能量则以衍散、折射、反射等复杂的参数形式重新发射出来,这些参数与细胞体积、表面构象、内部结构形成函数关系,可测低角前面约10°的光散射及90°的光散射。
一般认为,90°位置的光散射值主要受细胞内部结构所致的光反射和折射影响,而低角前面10°位置的光散射则主要代表细胞大小。光散射测量方法如下:
(1)将细胞悬浮于HBSS中,浓度介于1×106~2×106/mL浓度之间。
(2)以悬浮细胞平衡盐溶液(HBSS)充满含鞘液的细胞贮藏池。
(3)设定细胞流量为500个/S(秒),以获得最佳测定结果。
(二)染色法
1 细胞的碘化丙锭(propiolium iodide PI)染色
PI和EB(溴化乙锭)为同类物质,与EB一样,PI嵌入DNA双螺旋中,可使荧光强度增加约20倍,PI的荧光强度约为EB染色的1.8倍,以488nm波长激发,DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。
1.1 小鼠Lewis肺癌细胞(3LL)DNA含量测定方法
(1)从C57BL/6小鼠上切除肿块,在培养皿内用PBS冲洗;
(2)去除结缔组织及脂肪,剪碎肿块;
(3)小碎片移入1.20×38mm注射针,加压使其通过,于4℃条件下重悬细胞于HBSS中。
(4)将200~300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL),染色3LL细胞,于4℃存放20~30分钟。
(5)测定580~750nm之间的发射荧光,以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。
注:PI染色液:0.1%柠檬酸钠1000mL+PI5mg+1%Nonide P40水。
1.2 培养细胞DNA的流式细胞仪分析
(1)从培养皿中吸去培养基,以HBSS冲洗二次;
(2)加入PI5mL于培养皿中,在4℃放10分钟;
(3)用吸管反复次打细胞,使细胞破坏,胞核释放出来,再行流式细胞仪分析。
1.3 完整细胞DNA的PI染色
(1)70%乙醇固定的细胞悬液,离心,去固定液;
(2)室温条件下加入PI染色一批细胞(105~106细胞/mL),时间为30分钟,然后行流式细胞仪分析。
1.4 光辉霉素和PI的DNA染色
在荧光抗生素光辉霉素和PI联合染色过程中,光辉霉素的供体分子被PI的受体分子接受产生能量转移,该染色技术主要用于实体肿瘤组织,精子细胞及妇科标本,同时也适用于体外培养的细胞。
(1)分离制备的细胞悬液即可使用,若用70%乙醇固定可保存一周。
(2)以PI/光辉霉素染色,4℃1小时(PI为10 mg/L、光辉霉素为10 mg/L)。
(3)染色后进样,以100W汞灯作为激光光源,使用BG123nm阻断滤片,叠加K590型高通滤法(one seep filter)。
2、DNA和RNA的鉴别染色
利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定,非固定细胞核酸,或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果,但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下:
(1)试剂:
溶液A:低温保存,稳定期约2周。
Triton X-100(0.1%) 0.1mL,1mol/L HCL 8mL
1mol/L NacL 15ml蒸馏水76mL,PH1.5(100mL)
溶液B:稳定期数月,最好除菌以后(高压或过滤)贮存。
0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L Nacl15mL
0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L柠檬酸18.5mL
蒸馏水24mL,总体积为99mL pH6.0
吖啶橙母液:
用吖啶橙/蒸馏水配成1mg/mL(致癌物,应小心),吖啶橙应用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀释。
注意:仪器鞘流系统应保持4℃。
氩激光激发波488nm,红色荧光为DNA(F>600nm),绿色荧光为RNA或单链DNA(F>530nm)
(2)方法
①用含15%血清的PBS配制细胞悬液,取0.2mL(8×106细胞/mL),加入0.4mL溶液A,4℃放置45~60秒。
②加1.2mL含吖啶橙的溶液B,室温2分钟。
③应在加入溶液B后10分钟内进流式细胞仪分析。
注意:①细胞数保持恒定;②核酸与吖啶橙的比例;③染色时间及温度。
(三)染色法的应用
1、变性及双链DNA的鉴别染色
(1)试剂:
HBSS内含1000u/mL RNA酶A,0.2mol/L KCl pH1.35
吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4缓冲液,pH2.6。
①2×106细胞悬于1mL HBSS/RNase液中。
②37℃温育1小时。
③将0.2mL细胞悬液(含4×105细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混匀,20℃ 30分钟。
④加2mL吖啶橙染色2分钟。
⑤绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA含量。
2、DNA与癌基因探针双标记测定
这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产物,然后用PI标记DNA,现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤:
(1)制备白血病细胞悬液,用100%甲醇在-20℃固定10分钟。
(2)取50μl50 mg/L的癌基因探针Y13-25(它是一种广谱单克隆抗体,可特异性地直接与N-ras,Ki-ras和Ha-ras三种癌基因编码的21Kd蛋白相结合),4℃作用30~45分钟。
(3)用PB离心洗涤2次,重悬浮于50μL HBSS中(含0.1%叠氮钠和2%小牛血清)。
(4)加入50μL 1:200兔抗鼠IgG,4℃放置30~45分钟。
(5)同(3)洗涤后加入50μL 1:40的FITC标记的羊抗兔IgG,4℃反应30~45分钟。
(6)同(3)洗涤后,细胞用RNA酶消化,室温20~30分钟。
(7)同(3)洗涤后,用PI染液染20分钟。
(8)同(3)洗涤后,用488nm激发波长测定。FITC染色显示ras癌基因表达产物,PI染色显示DNA含量。
注意事项:
①制备样品时,离心次数不宜过多,防止细胞丢失和凝集;
②细胞固定时间不宜过长,不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定剂;
③为了降低本底,应将细胞表面未结合的荧光染料洗净;
④进行双标记沉淀时,应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素。
3、以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料进行细胞周期分析。
(1)试剂:
用培养基配制33 mg/L Brdu及脱氧细胞苷26.4g/mL。
染色液:Hoechst33258溶于PBS,细胞染色24小时后进行分析,据报道染色的稳定时间在30分钟至24小时之间。
(2)方法:
①将Brdu溶液按1:10加入细胞培养液中。
②根据细胞周期时间不同,选择不同时间培养的细胞。
③孵育后,摇散细胞以传代培养。
④直接用染液重悬细胞,进入流式细胞仪分析。
Hoechst33258荧光值在410~580nm之间,需用330~360nm紫外光激发。应特异性结合腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对。因此,不仅特异性标记DNA,亦可标记胸腺嘧啶。在细胞周期分析时,在与细胞孵育过程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶,因此,处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态,并在分裂后G1峰的半峰处产生一新峰,此项技术可用于直接测定细胞G2期及分裂时间。
4、Hoechst33342染色活细胞DNA
(1)试剂:Hoechst 33342,用蒸馏水配成0.25mol/L。
(2)方法:
①制备106/m细胞悬液,以Hoechst33342染色,浓度为5~10 mg/L ,室温下20分钟。
②分析前切勿洗涤细胞。
Hoechst33342可用作细胞DNA的活体染料,据信可在保持细胞活性的同时,呈现出相当好的DNA化学计量关系,激发波在紫外范围350~363nm之间,发射波则在450nm处。
5、以异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyante FIFC)染色蛋白质。
(1)试剂:异硫氰酸荧光素(FIFC)用含40 mg/L RNase的PBS配成0.1~1.0 mg/L浓度。
(2)方法:
①染色前用终浓度70%乙醇固定细胞,至少18小时。
②离心固定细胞,弃去固定液。
③室温下用FIFC染色细胞蛋白,30分钟。
④流式细胞仪分析,使用氩激光,激发波长488nm,荧光发射波长515~535nm。
也可于固定细胞中,以18 mg/L (0.1%柠檬酸盐配制)和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/L RNase,PBS配制)染色20分钟以上可对DNA和蛋白质双重染色,分别呈现红色荧光(DNA)和绿色荧光(蛋白质)。
6、荧光素抗体的应用
该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞,可用荧光素或若丹明标记单克隆抗体处理上述细胞;也可用于测定胞浆中的蛋白质(如凋亡BCL-2蛋白,抗病毒蛋白MXA等)。
用磷酸盐缓冲液Eagle's MEM稀释FIFC连接的抗体内含0.1%叠氮钠、2%牛血清。为判定FIFC抗体的最适度的稀释浓度,向微量滴定板的细胞中加入50μL不同浓度的稀释液,再以荧光显微镜确认最佳染色浓度。使用抗人LEU-I抗体分析时,应稀释成5 mg/L或 0.25 mg/L。无论鼠或人细胞在2×107浓度时其存活率应在90%以上。
方法:
(1)于微量滴定板加入50μL抗体稀释度,再加入50μL细胞悬液,混匀。
(2)冰浴45分钟,离心滴定板(1500r/min 10分钟)。
(3)弃上清,以培养基100μL洗涤细胞沉淀2次,每次洗涤后用1500r/min 10分钟,弃上清。
(4)以1ml预冷的培养基配成1×106细胞/mL的已染色细胞悬液,进样前持续保持冷环境(4℃)。
(一) 原理
活细胞表面保留有较完整的抗原或受体,先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合,再用荧光标记的第二抗体结合,根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
(二) 操作步骤
制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
↓
用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为
5×106~1×107/ml
↓
取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μl)
的小玻璃管或塑料离心管,再加50μl 1∶20(用DPBS
稀释)灭活正常兔血清
↓4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2ml左右
1000rpm×5min
↓
弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠
(或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇
↓ 4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右
1000rpm×5min
↓
加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入
1ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察,
视细胞浓度加入100~500μl固定液)
↓
FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
(标本在试管中可保存5~7天)
(三) 试剂和器材
1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体,灭活正常兔血清。
3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(四) 注意事项
1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaNO3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
附:
1. DPBS (×10, 贮存液)
NaCl 80g
KCl 2g 蒸馏水加至1000ml
Na2HPO4 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH2PO4 2g
2. 洗涤液
DPBS 900ml
FCS 50ml (终浓度 5%)
4%NaNO3???50ml (终浓度0.2%)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖 20g (终浓度2%)
甲 醛 10ml
NaNO3 0.2g (终浓度0.02%)
(一)直接免疫荧光标记法
取一定量细胞(约1X106细胞/ml),在每一管中分别加入50μl的HAB,并充分混匀,于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色,可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入),。孵育20-60分钟后,用PBS(pH7.2—7.4)洗1-2次,加入缓冲液重悬,上机检测。本方法操作简便,结果准确,易于分析,适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高,但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰,因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法
取一定量的细胞悬液(约1X106细胞/ml),先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,再加入荧光标记的第二抗体,生成抗原—抗体—抗抗体复合物,以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低,二抗应用广泛,多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。
1.荧光标记的抗体的浓度应该合适,如果浓度过高,背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2.在使用第一抗体之前,将样品与过量的蛋白一起培育,如小牛血清蛋白(BSA),脱脂干奶酪,或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。
3.在使用第一抗体之后,将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。
通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面,但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合,或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。
4.使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此,在NaN3存在的条件下,将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下,即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子,FC受体决定的背景影响已不再重要。
5.其它:已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景,在多重标记过程中,所有的已标记的抗体应被吸附,避免其他种类蛋白的交叉反应。
随着研究的进展,仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括:ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析(limiting dilution analysis,LDA)和单细胞PCR,应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞,此方法可获得较强的细胞内信号,但此方法工作量大、主观性强,难以进行大样本检测,且人肉眼识别能力有很大的局限性,而ELISPOT及单细胞PCR技术,技术性强、劳动强度大,难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现,使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
一、简介
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成,如TH1(IL-2,IFN-)与TH2(IL-4,IL-5,IL-10),但这些研究很难外推,因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。近来,Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵,用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集,蓄积,增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下,T淋巴细胞产生少量的细胞因子,通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中,T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来,胞内细胞因子信号较弱,难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子,并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化,且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明,只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子,静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合,即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌,同时采用特殊的化学与抗体选择,确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点:
快速:流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成,实验流程需6-8小时,实际操作时间为1-2小时,快速简便;
简便:无需组织培养,可以全血分析,无需分离PBMCs;
灵敏度高:高度灵敏的荧光标记与检测系统;
高效:可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子,也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型,进行多参数相关分析;
安全:减少样本处理与生物源性污染
接近生物体的分析条件:全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。
二、所需仪器
1. 流式上样管及细胞培养皿或板
2. 25%CO2,37℃孵箱
3. 混匀振荡器
4. 离心机
5. 加样器、Tips
6. 流式细胞仪
三、常用的标本类型和处理方法
全血:使用肝素钠抗凝的真空采血管采血,不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂,血样在8小时内分析,超过8小时会导致活性的损失,一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测,应将真空采血管水平室温放置。
自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs):使用肝素钠抗凝的采血后,分离PBMCs,24小时内分析。
组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs):用Ficoll分离PBMCs,将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中,调节细胞浓度为2×106细胞/ml。
细胞系与T细胞克隆:调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。
冰冻全血与PBMCs:使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs,用PBS漂洗,并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬,-70℃冻存。溶化后细胞置于染色管中,加上2~3mL的洗液,离心5分钟后,用破膜剂对细胞进行破膜和染色。
四、所需试剂
1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂
依据实验需要选择特殊表面标志
CD45圈定所有淋巴细胞
CD3 圈定T淋巴细胞
CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群
CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群
CD19/或CD20圈定B淋巴细胞
CD56圈定NK淋巴细胞
CD14圈定单核细胞
2、荧光标记的细胞因子抗体:R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体
3、溶血素:用外周全血检测时需使用溶血素(R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠;eBioscience目录号00-4333)溶解红细胞
4、激活剂
① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Alexis,目录号ALX-445-004-M001)
A. DMSO中调节浓度0.1mg/mL
B. 分装(20L),-20℃储存。勿反复冻融
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1:100稀释储存液
D. PMA终浓度25ng/mL细胞悬液
② Ionomycin (Alexis,目录号ALX-450-006-M001)
A. 于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL
B. -20℃储存
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1:10稀释储存液
D. Ionomycin终浓度1g/mL细胞悬液
③ Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)
A. 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL
B. 4℃储存
C. SEB终浓度10g/mL细胞悬液
④ CD3:包被在培养板中,在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞
⑤ CD28:加速不同刺激剂(包括SEB、CD3等)的活化效应,浓度一般为10ug/ml
5、阻断剂
阻断高尔基体介导的转运作用,使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内
① Brefeldin-A(BFA) (eBioscience,目录号00-4506)
A. 于DMSO中调节浓度5mg/mL
B. 分装(20L),-20℃储存。勿反复冻融。
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1:10稀释储存液
D. 激活最后4-5小时BFA终浓度10g/mL细胞悬液。
注意:BFA过度孵育会导致细胞活力下降
② Monensin (eBioscience,目录号00-4505)
6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640
7、 固定剂:细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内,另一方面避免细胞表面抗原丢失。含4%的多聚甲醛PBS溶液(eBioscience,目录号00-8222)
8、 破膜剂:含1%皂甙、0.05%叠氮化钠的Hanks溶液(HBBS)(eBioscience,目录号00-8333)
将细胞膜穿孔,已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内,于相应的细胞因子结合
9、其它试剂:无菌无叠氮钠PBS,乙醇,含1%多聚甲醛的PBS,4℃储存。
五、细胞培养和刺激的基本方法
细胞活化的最终结果是产生细胞因子,根据检测指标和标本的不同,研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间,以获得最佳的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。
表 细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法
检测细胞因子 阳性对照刺激方法
人IFN- 方法2 (4-24 小时)
人TIMP-1 方法5
人TNF- 方法7 (6 小时)
人IL-1 方法3 (6 小时)
人IL-1 方法3 (24 小时)
人IL-2 方法2 (4-24 小时)
人IL-4 方法4
人IL-5 方法1
人IL-6 单核细胞:方法3 (6-12 小时) T细胞:方法6
人IL-10 方法1
人IL-12 方法8
人IL-15 方法3
人Fractalkine/CX3CL1 方法1
人IL-8/CXCL8 方法3 (24 小时)
人MCP-1/CCL2 方法3 (24 小时)
人MIP-1/CCL3 方法3 (24 小时)
人MIP-1/CCL4 方法3 (24 小时)
人RANTES/CCL5 方法1
小鼠IL-2 方法9
小鼠IL-4 方法10
小鼠IL-5 方法10
小鼠IL-6 方法11
小鼠IFN 方法9 or 方法12
小鼠TNF- 方法9
为防止细胞内细胞因子分泌到胞外,在培养的最后4-6个小时,需要使用蛋白转运抑制剂 (如3uM monensin,10mg/ml的BFA)
方法1: 只使用转染细胞检测
方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.
方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.
方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4+细胞在包被人CD3抗体的培养板中,使用含有重组人的IL-2(10 ng/ml,目录号202-IL-010)和IL-4(10 ng/ml,目录号204-IL-005)的培养基培养两天;细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天;最后收获细胞,使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时
方法5: CD4+ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days
方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1 (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)
方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激
方法8: PBMCs细胞使用重组人IFN (10 ng/ml,目录号285-IF-100) 刺激2 小时,然后使用IFN (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.
方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中,使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时
方法10: CD4+T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中,使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体,重组小鼠的IL-2(10 ng/ml,目录号402-ML-020)和IL-4(50 ng/ml,目录号404-ML-005)的培养基培养两天;然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天;最后收获细胞,使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。
方法11: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时
方法12: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时
六、流式检测细胞染色基本过程(以全血为例)
1、 收获细胞:肝素钠抗凝的静脉血,按1:1与培养基混匀,加刺激剂,同时加蛋白转运抑制剂(参照说明书), 混匀后,37℃,5%二氧化碳培养4-6小时
2、 阻断Fc受体:用于消除非特异性的结合染色
① 在小鼠,可使用纯化的FcII/III受体的抗体(CD16/32),按照1ug/106细胞的用量,在染色缓冲液中4℃孵育15分钟,PBS清洗后,直接进行下一步染色。
② 对于人和大鼠,可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断
3、细胞表面染色
① 加适当的细胞表面染色试剂20L于Falcon管中,加入100L激活后的全血 (细胞浓度维持在2×106/mL) 混匀,室温暗处孵育15分钟;
② 加入溶血素,室温暗处孵育10分钟。(注意:PMA激活的全血可能会溶血不完全。)
③ 离心500g 5分钟,弃上清
4、固定和破膜
① 加固定剂,室温暗处孵育15分钟,离心500g 5分钟,弃上清;
② 加破膜剂温暗处孵育10分钟。(剂量参照说明书)
③ 加23mLPBS洗液,离心500g 5分钟,弃上清。
5、细胞内染色
① 加入荧光标记的细胞因子抗体,混匀,室温暗处孵育30分钟。
② 加23mL洗液,离心500g 5分钟,弃上清,加入500LPBS上机或加入500L 1% PFA固定后再上机
七、注意事项
1. 标本处理:避免使用络合钙的抗凝剂,如ACD与EDTA,因为它们会限制钙依赖性激活过程,推荐用肝素钠。此外LPS,一种常见的生物试剂污染物,是强细胞激活剂,可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析,超过8小时会导致活性的损失,一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测,应将真空采血管水平室温放置。
2. 刺激激活:检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间,以保证最佳的检测效果。比如,要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激;如果用CD4做表面标记,由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调,所以培养时间不能太长,4-6小时为宜,否则CD4下调影响分析
3. 选择合适的对照:为保证结合的真是和可靠性,至少荧光设置以下对照:
① 未刺激对照:激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运,因此在激活过程中产生 的抗原与细胞因子会滞留胞内,未刺激对照也应包含BFA。
② 激活对照:激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否,如果未达到CD69期望的水平,则激活步骤出了问题,某一试剂可能失活,过期,制备不当或溶剂污染,需制备新鲜刺激剂重新实验。
③ 同型对照:使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
4. Fc受体阻断:使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色,在小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32(eBioscience, 目录号14-0161-81),在大鼠可以用纯化的抗大鼠的CD32,在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。
5. 荧光素的选择:检测相对低表达细胞因子如IL-4时,应选用PE或APC标记;单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记;同时检测多种细胞因子时,弱表达的应选用PE或APC,FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-γ
八、问题与解答
一、使用流式分析方法检测血小板活化的优点
1.检测血小板的反应性。
2.了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化,然后是胞浆内颗释放到血小板外。
3. 同时检测多种血小板表面标志。
4. 高度灵敏。
5. 直接检测血小板的多种标志。
6. 使用全血,标本量少。
7. 操作简便快捷,将血小板人工激活减至最低。
二、全血中活化血小板的检测
1. 血小板特异性膜糖蛋白:血小板膜糖蛋白已被深入研究,下表显示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在这些膜糖蛋白中,仅在血小板膜表面表达主要有GPⅠb,GPⅡb,GPⅢa等有限的几种,根据这些特异性糖蛋白制备的荧光单抗,能在全血中特异性地识别血小板。
2. 活化血小板的标志物:活化血小板与静息血小板相比,其质膜糖蛋白常发生显著的变化,这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物,这些标志物可分为三类:第一类是血小板颗粒膜上的糖蛋白。血小板被激活时,其颗粒膜与质膜发生融合,颗粒膜蛋白,如CD62、CD63,在质膜上表达,成为活化血小板的分子标志。第二类是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa(CD41/61)的PAC1表位,它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。因此,使用这个表位的荧光单抗,我们能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。另外,GPIV (CD36)虽然在静息血小板上也表达,但活化血小板上表达量更高;GPIb-IX-V复合物(CD42)则相反,与静息血小板相比,活化血小板上表达量显著降低。第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原,包括纤维蛋白原,Xa因子和thrombospondin等。这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。
3. 除检测免疫性的分子标志物外,流式细胞术还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。如用Ca2+浓度敏感的荧光染料检测胞内Ca2+流,用能进入血小板致密颗粒的荧光染料阿的平来检测活化血小板的释放功能等。
4. 单抗的选择:与血小板有关的CD单抗有CD9,CD31,CD36,CD41a-b,CD42a-d,CD61(特异的泛血小板表面标记,既与活化血小板结合,也与未活化血小板结合。CD61与CD41联合,即为血小板表面gpⅡb/Ⅲa复合物),CD62,CD63 ,CD107a-b等,。活化血小板的检测需选择针对活化血小板标志物的CD单抗。表2列举了活化血小板检测的一些代表性单抗。
三、操作步骤
1. 标本采集:
(1) 枸橼酸钠抗凝的真空采血管顺序编号。
(2) 抽取静脉血,采血管中注入2ml。
(3) 于10分钟之内完成血小板激活和染色步骤,操作时应注意减少人工激活。
2. 血小板激活:
(1) 试管内加入50mlADP(也可选用其他激活剂,如PMA、纤维蛋白、TRAP),450l全血,轻轻摇匀。
(2) 室温孵育5分钟。
(3) 立即染色。
3. 荧光抗体染色:
(1) Falcon管编号。
(2) 在对照管中加入同型对照、CD61、PAC-1和RGDS(PAC-1的阻断剂)。
(3) 在试验管中加入CD62P、CD61和PAC-1。
(4) 在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本5l。
(5) 轻轻混匀,室温暗处孵育15-20分钟。
(6) 各管中加入1ml冷的固定液 (2-8C),充分混匀, 2-8C阴暗处放置30分钟。
(7) 24小时内上机分析。
4. 结果分析:
在CD61 vs SSC点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群,
CD61阳性/低SSC一群主要由单个血小板组成,CD61阳性/高SSC一群主要由黏附血小板的血细胞组成, CD61阳性/散射光更低的一群主要由血小板来源的碎片组成。由于在生理和病理情况下,血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉,因此,不建议使用FSC-SSC图设门。 在CD61 vs SSC点图中找出CD61 阳性的血小板群 (单个血小板和黏附在WBC上的血小板),设门。
注意事项
1. 采血时请用大号针管,抽出的前2ml血应弃去不用。
2. 尽量避免标本受到物理振动。
3. 取血后10分钟内完成染色操作。
4. 在Falcon管中加血标本5l,管壁上不能有残留血,未染色的部分会影响试验结果。
5. 为了检测和控制血小板体外激活,建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制。
血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术,它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法,丰富了血小板功能评估指标。
一、流式细胞仪血小板分析应用范围
1. 通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成,分析血小板活化,血小板对刺激物的反应性。
2. 通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测,分析血小板止血功能的获得性和遗传性缺陷。
3. 结合血小板大小,检测血小板RNA含量,分析血小板成熟度,计数网织血小板。
4. 发现血小板抗体,做定性和定量分析。
二、血小板分析的临床意义
1. 血栓性疾病:活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性,非风湿性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化,胰岛素依赖性糖尿病,子痫前期,外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板,而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的体外激活能力降低。
2. 血小板缺陷性疾病:全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病,如巨大血小板综合征,血小板无力症等。前者是由于GPIb-IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大,功能异常的出血性疾病。后者由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷,导致血小板聚集功能障碍
3. 贮存池疾病:原发性贮存池疾病(δ-SPD)常规用血小板聚集法检测,但特异性和灵敏度均不理想。检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法,主观性大,操作繁琐,而且一次检测的血小板数目有限。全血法流式细胞术为δ-SPD的诊断提供了一个简单、迅速的方法,一次能定量检测5 000个以上阿的平染色的血小板。与正常人相比,δ-SPD患者阿的平染色显著下降(从49%降至15%)。常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病,也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。
4. 血小板减少性疾病:破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。血小板相关抗体(PAIg)是反映血小板的破坏的指标,虽然其临床意义仍有争议。PAIg的检测有多种方法,但流式细胞术法有其优越性。流式细胞仪能测定单个血小板上的PAIg,只要测定104甚至103个血小板,在统计学上就能精确地得出PAIg的平均水平,因而用血量少,只要1 ml血液制备的血小板就足够。流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标,如PAIgG、PAIgM、C3等。血小板的生成与巨核细胞有关,全血法流式细胞术能像检测网织红细胞那样,检测分泌到循环中的“网织”血小板,来判断血小板的生成。“
5. 血小板储存与输注:用P-选择素(CD62)、CD63、GPⅡb/Ⅲa作分子标志物,发现血库中储存血小板有时间依赖性的活化现象。储存5天以上,40%~60%血小板表达活化标志CD62。虽然其形态改变、乳酸脱氢酶泄漏以及β-TG的释放也能反映其活化,但用CD62作为储存血小板的质量控制指标最理想。活化的血小板在循环中的存活时间很短。若血小板在储存时活化了,即使输注也不能很好地提高患者止血能力。
6. 抗血栓药物的监测:活化血小板的检测可以判断患者是否需要抗血栓药物治疗,也可以监测这些抗血栓药物的作用,避免毒副反应的发生。
7. 此外,全血法流式细胞术还可用于检测血小板聚集,研究其免疫表型HPA-Ⅰa,测定严重血小板减少患者的血小板数目。
三、流式细胞仪分析全血中血小板的优点
1. 全血中血小板更接近生理状态。
2. 操作简便,减少由于操作造成的血小板状态改变(如血小板活化试验)。
3. 同时检测血小板的多个标志物,结合FSC和SSC,评估多个参数,进行定量分析。
4. 多采用血小板特异抗体CD41或CD61画门,找出血小板,避免杂质碎片的干扰。
5. 检测血小板亚群灵敏度高。
6. 用血量少。
7. 无放射性污染。
四、全血样本的制备
1.抽取抗凝全血:检测血小板功能时,应使用标准化的抽血规程。做血小板活化试验时,应尽量减少人为造成的血小板活化。
2.Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体,充分混匀,室温避光处反应,通常放置15分钟。
3.1%多聚甲醛固定样本。
4.上机检测
五、质控标本
1. 阴性对照(Isotype Control):非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度,应与试验管抗体相对应。在多色分析时,同型对照应与其它抗体同时使用,以避免补偿造成的误差。
2. 血小板体外活化试验:使用正常人活化标本作为阳性质控。使用正常人未活化标本作为阴性质控。
3. 血小板自身抗体检测:使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育,作为阳性质控。使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育,作为阴性质控。
4. 血小板表面抗原缺失:如巨血小板症血小板表面CD42a/CD42b缺失,血小板无力症血小板表面gpIIb/IIIa,即CD41/CD61缺失或异常。使用正常人标本做阳性对照,抗体的同型对照做阴性对照。
六、数据分析
流式细胞分析(Flow cytometry,FCM)是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术,它具有如下几个特点:①标本只要是单细胞即可用于分析,如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等,实体组织只要经处理后制成单细胞悬液也能分析,因此,实际上所有组织细胞均可用于分析。②极短时间内可分析大量细胞,只要标本中的细胞数量足够,流式细胞仪(Flow cytometer)可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量,测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。③可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数更为准确。④定性或定量分析细胞:通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性、细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。
由上述几个主要特点可知,FCM是一种在医学基础、临床及科学研究中有着广泛的应用前景的细胞分析技术,尤其是随着人类基因组计划完成后,流式细胞分析在单细胞水平研究基因的表达、调控及功能等也将有着更广泛的应用。近年来,随着流式细胞仪性能的不断改进和测定方法与技术的迅速发展,流式细胞仪迅速进入临床实验室,临床流式细胞分析(Clinical flow cytometry)在临床检验医学中的应用范围不断拓宽,一些检验项目已成为临床疾病诊断、治疗方案选择、预后判断等不可缺少的内容。
当前,临床流式细胞分析已成为检验医学发展的一个热点,其发展趋势主要体现在以下几个方面。
一.从相对细胞计数到绝对细胞计数
流式细胞分析最大的优点是对混合细胞群体中亚群细胞的计数,如淋巴细胞可依其表面标志的不同分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-),T淋巴细胞又可进一步分为辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+CD8-)和抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD4-CD8+)等。这些亚群细胞计数过去多以相对百分比表达结果,由于百分比只能代表每种细胞在混合细胞群体中所占的比例,并不能体现在单位体积血液中的绝对数量,而现在临床一些疾病的诊断需要考虑细胞的绝对数量,如艾滋病患者的血液中辅助/诱导T细胞(CD3+CD4+CD8-)<200个/μL,而仅有HIV感染而未发病者的>200个/μL。T淋巴细胞亚群的绝对计数在国外实验室早已成为常规检查,而国内仅有少数实验室开展。
流式细胞绝对计数在临床可开展的项目包括:①淋巴细胞亚群,尤其是T淋巴细胞亚群的绝对计数。②外周血或骨髓中造血干/祖细胞的绝对计数。③血液中网织红细胞的绝对计数。④血液中血小板数量,尤其是血小板减少症患者血小板的绝对计数,此种计数优于血细胞分析仪法,已成为血小板计数的国际推荐参考方法。此外,可能出现在血液中的其它一些稀少细胞(如内皮细胞、转移的肿瘤细胞等)的计数,也将发展为流式细胞绝对计数。流式细胞绝对计数的开展对临床疾病的诊断、治疗等有重要意义。
二.从相对定量到绝对定量分析
细胞的多种成分如某些抗原或受体表达的流式细胞分析,以前多以平均荧光强度(MFI)或相对荧光强度(RFI)表达其含量。由于流式细胞仪每次的仪器状况可出现差异,每个实验室所用仪器的类型也不尽相同,以MFI或RFI表示某些细胞的抗原或受体的表达量缺乏可比性,虽然流式细胞仪有极高的荧光灵敏度,但却无法准确应用这些信息。近年来,为了通过FCM精确定量分析细胞的某些成分,定量流式细胞术(Quantitative flow cytometry,QFCM)逐渐得到发展,其定量分析原理主要有两种:①定量抗体微球法:在特制的微球上包被已知分子数的羊抗鼠IgG分子,再将包被不同分子数的微球混合,形成含不同羊抗鼠IgG分子数的混合微球,此微球与待测标本在相同条件下与荧光素标记的单克隆抗体(McAb)反应后在流式细胞仪上测定其荧光强度,根据微球上所包被的羊抗鼠IgG分子数和与之对应的对数荧光强度计算回归方程,再将待测样本中阳性细胞的对数荧光强度代入方程即可求得其每个细胞上的平均抗原分子数(抗原结合位点数)。②定量荧光素分子微球法:在特制的微球上直接包被荧光素分子,再将包被不同分子数的微球混合,形成含不同数量荧光素分子的混合微球。在流式细胞仪仪器设置相同的条件下测定此微球及待测细胞的荧光强度,根据微球上所包被的荧光素分子数和与之对应的对数荧光强度计算回归方程,再将待测样本阳性细胞的对数荧光强度代入方程,可求得每个细胞上的平均荧光素分子数,根据所用于样本测定的单克隆抗体(McAb)与荧光素结合的分子比例,计算每个细胞上的平均抗原分子数。单细胞的抗原或受体定量是流式细胞分析的重要进展,为研究细胞的生物学、生物化学及免疫学等性质提供了更精确的方法。例如,白血病性原始细胞的膜CD45分子表达量低于正常淋巴细胞,活化血小板膜CD62P、CD41分子数显著高于静止血小板,活化淋巴细胞的CD69分子数显著增高,活化中性粒细胞膜CD64分子数显著高于静止中性粒细胞,强直性脊柱炎患者T淋巴细胞膜HLA-B27分子数明显增高。CD8+T淋巴细胞膜CD38分子数增高是慢性HIV感染者病情发展或死亡的更有力的预后指标;AIDS治疗有效后,CD8+T淋巴细胞CD38分子数降低。
三.从单色到多色荧光分析
流式细胞分析从最初的间接免疫荧光染色、单色或双色直接荧光染色,一般只能分析单细胞的一种或两种信息。随着新的荧光色素分子的不断发现,荧光标记技术的进步和流式细胞仪的多激光激发等技术的进展,多色荧光分析得到迅速发展,三色、四色甚至五色或六色荧光分析对细胞亚群的识别、细胞功能评价等更为精确。目前,淋巴细胞亚群的分析、白血病免疫表型分析均应使用至少三色荧光以上分析才更可靠。例如:辅助/诱导T淋巴细胞四色荧光分析的免疫表型为CD3+CD4+CD8—CD45+,慢性淋巴细胞白血病的异常淋巴细胞的四色免疫表型为CD5+CD10—CD19+CD45+。多色荧光分析是流式细胞技术发展的必然趋势,有条件时应尽可能地采用。
四.从细胞膜成份到细胞内成份分析
流式细胞膜免疫表型分析是最重要的分析内容之一,很多细胞亚群的检测均是以膜免疫表型为主,如T、B淋巴细胞和NK细胞分析、白血病免疫分型等。然而,仅有膜免疫表型的分析是不够的,尤其对一些细胞的系列鉴定和功能状态分析常较为困难,而细胞浆或细胞核内成份则更能反映某些细胞的系列特征和功能变化。随着近年来细胞内成分检测技术的不断完善,细胞内成分检测已成为流式细胞分析的又一个热点。例如,急性髓系白血病性原始细胞浆中检测到髓过氧化物酶(MPO)是最为准确的系列标志,急性B淋巴细胞白血病性原始细胞浆中检测到CD79a是最为特异的系列标志;检测T淋巴细胞胞浆内细胞因子合成的种类及含量和膜CD69分子表达,是判断T淋巴细胞活化及其功能的重要手段,而且还能将辅助/诱导T淋巴细胞(Th)进一步分成Th1和Th2亚类,在Th1和Th2细胞浆中可分别合成γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-1(IL-1)和IL-4、IL-5、IL-10。通过细胞内成分检测技术与多色免疫荧光分析方法结合,可检测不同细胞亚群合成的不同细胞因子(Cytokine),如用五色疫荧光分析血液中淋巴细胞经诱导剂刺激后,辅助/诱导T淋巴细胞亚类—Th1细胞内有细胞因子合成的免疫表型为CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+。
五.液体中可溶性成分的流式细胞分析
从传统意义上讲,流式细胞技术只能分析细胞及其成分,液体中的可溶性成分则不能进行分析。然而,如果将液体中的可溶性成分结合在一种类似于细胞大小的颗粒(如乳胶颗粒)上,流式细胞仪便可以对其进行分析,这就是近年来发展起来的流式微球分析(Cytometric bead assay,CBA)技术。CBA的原理是将包被某种抗原或抗体的不同大小的微球与待测液体中的相应成分反应形成抗原与抗体的复合物,再加入荧光素标记的第二抗体,微球上结合的待测抗原或抗体分子数量与其荧光强度呈线性关系,由此可对待测液体中与微球上包被抗原或抗体分子相对应的成分进行定性或定量分析,例如同时测定血清或细胞培养液中的多种细胞因子,同时测定血清中多种自身抗体。CBA发展的时间虽很短,目前所能检测的项目还不多,但极具发展潜力。已知检测细胞因子的方法有多种,包括靶细胞功能分析法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点酶免疫分析(Elispots)等,但CBA与之相比,其灵敏度极高、可达2 pg/ml,而且能同时测定单个标本中的多种细胞因子。
六.流式分子表型分析
流式分子表型分析(Molecular phenotyping)是指用流式细胞技术检测细胞中特异性核酸序列或特异性基因异常。流式分子表型分析与免疫表型分析技术相结合,对于检测所选择细胞亚群的特异性核酸序列(如癌基因、病毒核酸等)检测,提供了一种非常有用的工具,具有广阔的应用前景。流式分子表型与免疫表型结合分析的基本技术路线是:①待测细胞首先与特异性细胞亚群的单克隆抗体反应,②固定并渗透细胞,③通过PCR进行引物特异的核酸序列扩增,④应用对扩增产物的特异性寡核苷酸荧光素标记探针进行荧光原位杂交(FISH),⑤加入针对细胞亚群单抗的荧光素标记的第二抗体。⑥流式细胞仪检测及数据分析。例如,流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光原位杂交(PCR-FISH)结合测定血液CD4+细胞中HIV特异的DNA或RNA,对于AIDS的病程监测、治疗反应及预后等有重要价值。流式荧光原位杂交(Flow-FISH)法测定染色体端粒长度:细胞的染色体端粒是由2~20 Kb串联的短片段重复序列(TTAGGG)n和一些结合蛋白组成,端粒长度越长,所含重复碱基数目越多;用荧光素标记的核酸-(CCCTAA)3端粒序列特异性探针进行FISH后经流式细胞仪检测,其荧光强度的高低可反映端粒的长短;Flow-FISH可测出小于3Kb的端粒长度差,对肿瘤的发生与发展、治疗与预后等的研究有一定价值。
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