讨论：pIRES2－eGFP转染细胞

参与者：水仙子2005

最近用pIRES2－eGFP做转染，可是看不到荧光（就连空载体也没有），由于实验要在3月底出结果，所以现在很急，准备寒假加班加点做。

有人说这个载体的GFP表达很不稳定，不知道有没有人用过这个载体，能否给点建议，对于好的建议愿以积分相赠。

参与者：Crazyvirus

不知你是固定以后观察荧光还是转染后直接看的，若是固定以后看，可能是荧光已丢失，GFP空载体固定后会存在荧光丢失导致看不到的现象，我就曾碰到过，若不是这个原因，就得考虑质粒或转染试剂是否有问题了，质粒提的质量不好或放置过久都会导致转染失败！找个别人用过确定可用质粒做个对照看看吧，祝好运！

参与者：水仙子2005

不知道你说的固定是指的什么？

参与者：su1202

你好：我是在24孔板转染的，具体操作基本上按照脂质体说明书，经过约20天

800UG/ML的G418筛选，空载体和重组的多有荧光，在FCM检测约为5%FITC（空细胞调零），在荧光显微镜也看到了（不需要固定，活细胞观察）.有图.

参与者：su1202

发错了，重发！

参与者：水仙子2005

请问su1202，在转染48h后（筛选前）有没有观察荧光，荧光强度，及表达量如何？ 还有就是他们说这个质粒GFP的表达很不稳定（时有时无，最后甚至消失，不知你有没有遇到这种情况？

参与者：su1202

转染48h后（筛选前）有荧光，但比例很低，只能看到几个，但无所谓，只要有就行了，要筛选，我在筛选后看过几次，GFP很稳定，一直有.最后祝你成功.

参与者：水仙子2005

前两天转了三个质粒今天上午看了荧光，只有其中一个质粒发了荧光，

而且发荧光的细胞很少，6孔板中几个视野里才一个发荧光的细胞

不过总算有了进步。

谢谢各位帮助，请版主给以上提供帮助者加分，或者直接转移我的积分。

参与者：sunliping1208

请问su1202，我也是在24孔板转染的，空载体和重组的都有荧光，但比例很低，荧光强度也很弱： 在FCM检测空载体强度为16%，重组的强度为2.2%.这是不是因为我构建的质粒不好，还是因为重组质粒转染率本来就比空载体低? 如果是后者，那么转染率通常是多少为好?

参与者：su1202

sunliping：你应该是筛选过的吧，如果达到16%荧光已经很高了，如未筛选就这样高，可能是FCM检测时调零有问题.重组质粒和空载体转染率是否有差别，那主要看你基因大小，一般1000左右差别不大.

参与者：wizblue70

楼主用质粒转染的目的细胞是什么？不同细胞的转染效率有很大差别。如果诸多文献公认的难转染细胞，用脂质体等化学转染试剂是不会明显提高转染效率的，这时建议考虑电转染或病毒载体。

参与者：sunliping1208

多谢楼上前辈的建议，我用的是HEK293T细胞，我没做筛选.文献上好象转染率都不低啊.电转后细胞死亡太多了而且细胞形态也变了."基因大小"是说质粒重组后的大小吗?我的是4.7KB ，对重组质粒和空载体转染率会有影响吗?

对不起，补充一下，因为我做的是启动子这一段，重组质粒转染率比空载体低会不会是说明启动子的效率低?

参与者：blueuniverse

不知道楼主用的是什么细胞？有的细胞很难转的。

这个质粒我用的很多，转过很多细胞，转染效率和细胞种类有很大关系。

但是有的时候是和转染试剂和操作有很大关系。

参与者：blueuniverse

293是很好转染的，楼主用的什么转染试剂，你们实验室别的人用的好吗？

参与者：blueuniverse

不知道楼主转染做什么用，一定要追求效率吗？如果是筛选稳定细胞系的话，不需要那么高的效率的

参与者：sunliping1208

我用的是lip2000，因为我是做启动子这一段的重组质粒，如果效率低，可以说明是我构建的启动子的效率低吗?重组质粒和空载体体外扩增时有差别（重组的明显少），是否转染也同样有这样的差别?

参与者：cristinwang1

请问su1202，你的稳定转染最后可以百分之多少的表达？，您说“经过约20天

800UG/ML的G418筛选，空载体和重组的多有荧光，在FCM检测约为5%FITC（空细胞调零）”，后来做亚克隆了吗？多少个克隆中有高表达的？我转染后G418筛选2周后，GFP荧光表达10%，分子表达16%，目前正在亚克隆，就亚了一块96孔板，不知道行不行？请多指导，不胜感谢！！

参与者：老板很忧郁

楼主的载体是不是PEGFP载体啊？我现在就用的是这个载体，现象和你说的差不多，荧光很弱，转染效率很低。加入G418筛选后，本来有荧光的最后都给筛没了。郁闷，就是不知道啥原因啊！