1. 溶液准备 2×样品缓冲液:130mM Tris-HCl ( pH8.0 ) , 20% ( v/v ) 甘油 , 4.6% ( w/v ) SDS , 0.02% 溴酚蓝 , 2%DTT PBS ( pH7.4 ) :10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4 ,50mM NaCl,2.7mM KCl RIPA缓冲液:50mM Tris-HCl(pH7.4),150mM NaCl,1mM EDTA,1%Triton×100 ,1%去氧胆酸钠,0.1%SDS,1mM PMSF,1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制剂 ( aprotinin ),1μg/ml亮抑蛋白酶肽 ( leupeptin ) 裂解液缓冲液:10mM Tris-HCl(pH7.4),0.15M NaCl,5mM EDTA(pH8.0),1%Triton×100;使用前加5mM DTT,0.1mM PMSF异丙醇和5mM ε-氨基己酸。 2. 裂解液的制备 A. 制备细胞裂解液: ①收集胰蛋白酶消化的细胞并离心,用PBS清洗。 ②用100μl RIPA缓冲液冰浴溶解沉淀10min(每500000个细胞20μl RIPA缓冲液)。 ③10000rpm,4℃离心10min,取上清转移至新管。 ④用考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度。 ⑤用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml,每小瓶中放100μl,-80℃储存。 ⑥按照1:1体积比混合2×样品缓冲液,煮沸5min后,室温放置5min. ⑦短时离心后点样电泳检测。 B. 制备组织裂解液: ①在制备过程中一直将溶胞液或组织放在冰上。 ②切开组织,称取组织1.5g于PBS中清洗。 ③在RIPA缓冲液中剪碎组织后,转移到匀浆器中,加足5ml RIPA缓冲液,研磨20min. ④将研磨液转移到1.5ml的离心管中,14000rpm,4℃离心10min. ⑤取上清液作为完整的组织裂解液。 ⑥用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。 ⑦用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml,每小瓶中放100μl,-80℃储存。 ⑧按照1:1体积比混合2×样品缓冲液,煮沸5min后,室温放置5min. ⑨短时离心后点样电泳检测。 |
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