动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。

2、细胞死亡与凋亡

大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中细胞死亡主要原因是细胞凋亡。随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入，细胞凋亡的发生被认为是大规模细胞培养过程的重要制约环节，预防并控制细胞凋亡也因此成为研究热点。

用基因工程方法将bcl-2基因这种细胞凋亡抑制基因导入细胞，成为众多研究者的选择。bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量,这对于细胞大规模培养具有重大意义。对细胞的这种保护作用依赖于bcl-2等抑制基因的高水平表达。因此，需要寻求在低表达水平便可达到目的的更强的细胞凋亡抑制基因。

在大规模动物细胞培养条件下，细胞凋亡/死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生。因此一种“细胞静止”过程可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，提高CHO细胞的目的蛋白产率。方法是向CHO细胞中导入p21、p27的基因，使细胞周期中G1期延长(细胞静止)，改造后，细胞活力正常，外源基因表达蛋白量提高。其优点是产品成本降低，产量提高，遗传一致性高。

3、培养基与细胞系

动物细胞培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素。在经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基成为当今细胞培养领域研究的一大课题。无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响。在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。但无血清培养基并不适用于广泛的细胞类型，不同类型的细胞甚至不同的细胞系或细胞株都有可能有各自的无血清培养基构成。在细胞早期培养阶段，细胞对于无血清培养基的适应性往往是克隆特异性的，每个新的克隆常需要重新配制培养基和适应过程。最近研究表明，先使野生型宿主CHO细胞适应无血清培养基培养，然后转染这些细胞得到的重组克隆在基因扩增后保持了在无血清培养基悬浮培养中的生长能力，其产品在生化和结构上类似于未处理的宿主细胞产物。

有些细胞株依赖于血清源性生长因子的特性可通过分子遗传途径予以改变，即导入特异生长因子的基因，使细胞能合成自身的生长因子来满足细胞生长需要，而对细胞生长无副作用。另外，导入一些基因改变细胞生长周期的调控也可使细胞在无血清/蛋白的培养基中生长。

通过细胞工程方法使细胞高水平表达外源基因并正确加工表达产物，从而提高整个表达系统的产率，也成为应用大规模动物细胞培养生产外源目的蛋白的研究的重要手段。这种潜在的目标便是改变细胞的蛋白加工能力。tPA表达水平及分泌效率均和它与内质网膜上的结合蛋白(BiP)这种分子伴侣的结合程度负相关。通过表达反义BiP转录物，tPA突变体与BiP的结合减少而分泌增加。在CHO细胞中通过稳定转染并过量表达BiP，阻止了未糖基化tPA突变体的分泌。因此，控制细胞中的分子伴侣能够使细胞正确折叠、组装、定位、分泌新合成的重组蛋白从而提高产量。

另外，控制外源基因表达的启动子的特性是基因表达的基础之一。强的启动子成为众所周知的选择。但是，SV40早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子调控基因表达均发生在S期，CHO细胞中腺病毒主要晚期启动子(AMLP)调控外源基因表达是在G1期。对于利用重组动物细胞生产外源蛋白而言，S期表达需要提高细胞的生长速率，在批次或灌流培养中会严重降低产量；G1期表达将使细胞在高密度培养条件下保持较低生长速率而大量生产蛋白。构建细胞系时，细胞周期特异表达调控具有重要研究和应用意义。

4、过程监控

大规模动物细胞培养中由于大量细胞的代谢，细胞培养环境迅速改变，在线过程监控更为重要。离线取样测定特别是产物浓度测定往往需要一天的时间，因此这种测定结果，不能用来及时指导生物反应器有关参数的控制和细胞培养环境的优化，而且频繁取样容易造成污染，增加费用。因此在线测定生物反应器中培养条件、代谢产物和目的产物浓度等大量数据，并对测定结果进行分析处理，及时对培养系统进行反馈性控制是成功进行大规模动物细胞培养的需要。

在生物反应器中，温度、pH值、溶解氧浓度是细胞培养规模放大的早期研究内容。现在，这三个参数对细胞的影响已经明确，并在培养过程中实行了有效控制。

最近几年中有关细胞培养过程监控的研究迅速增多。测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期生产病毒到病毒感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间；用在线葡萄糖分析仪的测定调整灌流速度；测定氧消耗估计营养供应率的代谢负荷和控制；测定氧吸收速率估测ATP的形成；测量在线氧化还原能力作为活细胞浓度的指标等等众多特定参数均得以测定并加以应用。细胞呼吸商似乎是衡量细胞生理状态的潜在的有用参数，可测定在线氧吸收速率并用质谱仪分析废气中二氧化碳呼出率计算呼吸商。一般来说，呼吸商应接近1.0，这就要求细胞培养中尽量降低氧消耗和二氧化碳排出。

用亲和层析与在线取样系统偶联进行在线蛋白质含量测定的方法已经完成。另外，用在线蛋白分解与反相色谱监测重组蛋白的糖基化以了解产品的一致性也成为一项有应用价值的技术。

5、结论与展望

可以推断，更多的代谢中间产物对细胞培养的细微影响和机理将逐渐得以充分认识。对这些因素加以调节可以简化筛选特定克隆的方法。细胞培养营养需要的重点将继续朝着维持或增加产品质量及一致性上努力。基因改建在筛选、扩增目的基因及控制其表达或增强细胞寿命等方面显示出强大生命力。改善细胞环境是当前众多生物反应器及控制器研究者的不懈努力方向。随着对细胞生长和产物生成之间相关性研究的深入，对生物反应器更多培养状态参数的在线检测以及各种新细胞生物反应器系统的开发利用，新的培养/控制模式将会在现有基础上不断产生。不断成熟的大规模动物细胞培养技术不仅在生产药用蛋白方面，而且在基因治疗、基因疫苗用的病毒载体的生产、人工器官和组织移植用分化细胞的培养等研究领域都具有广阔的应用前景。