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单克隆抗体(Monoclonal antibody)技术

标签: 单克隆抗体 细胞融合 杂交瘤 规模生产 制备

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单克隆抗体技术的发展编辑本段回目录

  1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交瘤细胞既可产生抗体,又可无性繁殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
  免疫细胞化学的 技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体,由于每种抗原都有几个抗原决定簇,用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体,即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的,所以它的免疫球蛋白属同一类型,质地纯一,而且它是针对某一抗原决定簇的,因此特异性强,亲合性也一致。
表  单克隆抗体(McAb)和常规免疫血清抗体的特性比较
项目 常规免疫血清抗体 McAb
抗体产生细胞 多克隆性 单克隆性
抗体的结合力 特异性识别多种抗原决定簇 特异性识别单一抗原决定簇
免疫球蛋白类别及亚类 不均一性,质地混杂 同一类属,质地纯一
特异性与亲合力 批与批之间不同 特异性高,抗体均一
有效抗体含量 0.01~0.1mg/ml(小鼠腹水) 0.5~5.0mg/ml(小鼠腹水)
  0.5~10.0μg/ml(培养物上清液)
用于常规免疫学实验 可用 单抗组合应用
抗原抗体形成格子结构(沉淀反应) 容易形成 一般难形成
抗原抗体反应 抗体混杂,形成2分子反应困难,不可逆 可形成2分子反应,可逆

单克隆抗体(monoclonal  antibody . McAb)技术在免疫学范畴内已经属于常规技术,在其他生命学科,如细胞生物学、遗传学、微生物学、生物化学、肿瘤学等领域内的应用也愈来愈广泛,目前这种应用已不局限在科学研究的范围内,单克隆抗体所引起的诊断学领域内的革命,在临床治疗学上的意义和其他经济领域内所产生的作用,也将愈来愈显著。
McAb技术的发明者G.Kohler和C.Milstein,1975年8月第一次报道了这项新技术,随后又不断加以推广,逐步改进和完善,他们因此而获得了1984年度诺贝尔医学奖。

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单克隆抗体技术的原理编辑本段回目录


    B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力,又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。
    制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基(培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H,氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T),在这种选择性培养基中,由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶,所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA,这一途径又被氨基喋呤所阻断,所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶,可以通过次黄嘌呤合成DNA,克服氨基喋呤的阻断,因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长,一般于二周内均死亡。
单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点:①单一特异性,与一个抗原决定簇反应;② 可重复性,能够提供完全一样的抗体制剂;③一经制出,可无限量地供应;④生产单克隆抗体,不一定需要纯的抗原;⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。

表  单克隆抗体与常规抗血清的性质比较
性   质 常规血清抗体 单克隆抗体
抗体含量 少 μg/ml 多 mg/ml
无关的Ig 多 少或几乎无
其它血清蛋白 有 少,培养物上清常有10%胎牛血清
Ag-Ab结合 免疫原的全部成分的全部抗原决定簇 免疫原中的一种成分的一个抗原决定簇
特异性亲和力的重复性 不同批号间有变化 无变化
与其它抗原的交叉反应 与带有共同抗原决定簇的抗原有部分交叉 一般无。结合到共同决定簇则是完全的
免疫球蛋白的种类与亚类 完全是混合的 只是一种或几种
免疫球蛋白的物理性质 典型光谱 抗体的单一性质

如果一个单一的B淋巴细胞既能分泌所需要的特异性抗体,又能体外进行不断增殖,就可进行规模化的McAb生产。然而现阶段这种可能性还不具备,所以人们必须考虑怎样去通过改变B淋巴细胞的遗传特性而建立一个能永久生长,并能分泌McAb的细胞系。
这一目标可以通过两条途径达到:
1、病毒转化
通过对脾脏B淋巴细胞进行某一特异性免疫,继而进行理化因素诱变或通过病毒转化,以致形成永久生长的细胞系。这种方法在制备人源McAb比较有用,如人的B淋巴细胞系可以通过EB病毒进行转化。
2、细胞杂交
通过对免疫动物B细胞和某一个永久细胞系进行融合,杂交后代称之为杂交瘤(Hgbridoma)。杂交瘤细胞可以将分泌特异性抗体B细胞的遗传特性和骨髓瘤细胞系体外增殖的遗传特性合二为一,这就是McAb技术的基础。

 McAb技术的特点
1、高度特异性。
McAb只识别并结合特定的抗原决定簇(Epitop),因此它对抗原的反应具有高度的选择性和专业性,即特异性。
2、高度稳定性。
杂交瘤生长和分泌单一抗体的特性能得到永久地保持,与它的遗传稳定性是分不开的,当然变异也是存在的,突变率通常与参加融合的骨髓瘤细胞系的种类有关,为克服变异的产生,常可通过亚克隆筛选法加以控制。
3、高抗体活性。
与多克隆抗体相比,McAb可以工业化大量生产,利用诱生腹水产生的McAb,显著高于任何一种多克隆抗血清的抗体效价,至少高出4倍。
4、不可知性
McAb的很多生物活性是不可预知的,对一个已知的抗原可能会产生许多不同的McAb,如抗不同的Epitop,就具有不同的亲和性,具有不同的抗体类型和亚型、不同的补体结合特性和亲细胞性等。
5、过于单一性,多克隆抗血清象一个调好的鸡尾酒,各种类型的有效抗体混合在一起。由于这众多的抗体的产生,对同一抗体来说就会导致抗体结合的多样性。比较起来,McAb相对于多抗就显得太专一了。在某些应用当中,常需要多种McAb配合使用才能达到目的。但专一性的优点是特异识别能力强,对抗原鉴别和特异标记物的临床诊断有重要的应用价值。

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McAb技术的应用编辑本段回目录

    McAb技术的实践意义在于首先体现在临床诊断学领域内的应用,它替代和补偿了那些由于特异性不够而不能满足需要的抗血清。因为很多疾病的被检物往往是某一个非常特异的抗原决定簇,所以只有高特异性的McAb才能很好地满足这种要求。如抗肿瘤标记物、抗激素和抗细胞表面分化抗原等。McAb试剂盒可以将一些肿瘤及白血病细胞的分型划分得更细更明确,有利于鉴别细胞分化类型,成熟程度。用同位素标记的抗肿瘤标记物McAb技术可用来进行放射追踪、定位。病毒和细菌性疾病免疫学诊断也可以通McAb技术进行方法学上的改进。
McAb技术最有前途的应用是肿瘤靶向生物治疗的作用,所谓的“生物导弹”治疗肿瘤可以通过两个途径发挥作用,一是McAb自身可以起到对肿瘤细胞毒作用,如美国Genetech公司最新推出的抗癌新药“Herceptin”,实质上就是一个基因重组的人源化抗乳腺肿瘤标记物的McAb。二是利用McAb与肿瘤标记物的特异性结合的特性,对肿瘤细胞发挥作用的是偶联在McAb上的细胞毒素或同位素。McAb用于治疗肿瘤还有待进一步研究。如一些肿瘤缺少很特异的标记物,一些原发瘤标志物会发生改变以及如何解决McAb人源化的问题等。这将取决于基因工程抗体的研究进展和应用效果。
McAb技术一个应用价值是对一些生物大分子的分离纯化,特别是一些常规方法难以纯化的生物制品,如基因工程人α干扰素,利用McAb亲和层析可以取得非常好的效果。
    杂交瘤技术包括免疫动物、细胞融合、筛选杂交瘤细胞、克隆化培养、单克隆抗体的制备与鉴定等步骤,其关键技术是细胞融合技术。
该项技术就是在聚乙二醇(PEG)的促融合作用下,将预先用抗原免疫的BALB/c小鼠的脾细胞(主要为能分泌预定抗体的B淋巴细胞)与具有无限繁殖能力的鼠骨髓瘤细胞融合成为杂交瘤细胞,这种杂交瘤细胞获得了双亲本细胞的特性,既有分泌预定抗体的能力,又可获得永生化,呈现无限繁殖能力。然而在细胞融合中,还可能存在B细胞与B细胞、骨髓瘤细胞相互融合的融合细胞及未融合的两个亲本细胞。在这些细胞中,自身融合的和未融合的脾脏B细胞在体外培养10天左右会自然死亡,而未融合或自身融合的骨髓瘤细胞以及与B细胞融合的杂交瘤细胞均可继续生长繁殖,但前者生长速度快,往往会抑制杂交瘤细胞生长,故必须在HAT选择培养基中进行选择培养。
在HAT培养系中,主要是添加了氨基喋呤用以阻断未融合的及自身融合的HGRPTase缺陷的骨髓瘤细胞,使之无法利用补充的次黄嘌呤和胸腺嘌呤核苷经旁路合成DNA,而导致死亡,唯有骨髓瘤与脾细胞中的B细胞融合的杂交瘤细胞不会受到影响。尽管氨基喋呤阻断了嘌呤和嘧定的内源性生物合成,但杂交瘤细胞仍可从B细胞中获得HGRPTase的遗传特性,经旁路利用HAT中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA,使杂交瘤细胞得以繁殖生存。

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单克隆抗体的生产编辑本段回目录

单克隆抗体的生产既可采用动物体作为生物反应器进行生产,又可采用人工生物反应器培养杂交瘤细胞进行生产,前者可通过诱发实体瘤及腹水瘤,从腹水中提取,也可采用牛淋巴液体外循环的中空纤维培养杂交瘤细胞法,从培养液中提取McAb,后者是采用体外大量培养杂交瘤细胞,从富含McAb的培养上清中提取,常采用旋转培养法,中空纤维培养法,悬浮搅拌培养法等。

单克隆抗体的制备方法编辑本段回目录

(一)动物的选择与免疫
  1.动物的选择  纯种BALB/C小鼠,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,食量及排污较小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
  2.免疫方案   选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
  (1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加佐剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
  初次免疫 抗原1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8~1ml,0.2ml/点)
  ↓3周后
  第二次免疫 剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml)
  ↓3周后
  第三次免疫 剂量同一,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价)
  ↓2~3周
  加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv(静脉内注射)
  ↓3天后
  取脾融合
  目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。
  (2)颗粒抗原免疫性强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例,免疫时要求抗原量为1~2×107个细胞。
  初次免疫 1×107/0.5ml ip
  ↓2~3周后
  第二次免疫 1×107/0.5ml ip
  ↓3周后
  加强免疫(融合前三天)1×107/0.5ml ip或iv
  ↓
  取脾融合
(二)细胞融合
  1.细胞融合前准备
  (1)骨髓瘤细胞系的选择:骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。
表 用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系
名称 来源 耐受药物 Ig链
   HL
P3/X63-Ag8(X63) BALB/C骨髓瘤MOPC-21 8-氮鸟嘌呤 r1  K
P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653) P3/X63-Ag8 8-氮鸟嘌呤 - -
P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1) P3/X63-Ag8 8-氮鸟嘌呤 - K(不分泌型)
P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul) (X63×BALB/C脾细胞)杂交瘤 8-氮鸟嘌呤 - -
SP2/0-Ag14(SP2/0) (X63×BALB/C脾细胞)杂交瘤 8-氮鸟嘌呤 - -
F0 BALB/C骨髓瘤 8-氮鸟嘌呤 - -
S194/5.XXO.BU.1 P3/X63-Ag8 5-溴脱氧尿嘧啶核苷 - -
MPC11-45.6TG1.7 BALB/C骨髓瘤MPC-11 6-巯鸟嘌呤 r2b  K
210.RCY3.Ag1.2.3 LOU大鼠骨髓瘤R210 8-氮鸟嘌呤 -  K
GM15006TG-A12 人骨髓瘤GM1500 6-巯鸟嘌呤 r1  K
U-266AR 人骨髓瘤U-266 8-氮鸟嘌呤 ε  λ
  骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液,如RPMI1640,DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%~20%,细胞浓度以104~5×105/ml为宜,最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时,可按1:3~1:10的比例传代。每3~5天传代一次。细胞在传代过程中,部分细胞可能有返祖现象,应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理,使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。
  (2)饲养细胞:在组织培养中,单个或少数分散的细胞不易生长繁殖,若加入其它活细胞,则可促进这些细胞生长繁殖,所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中,许多环节 需要加饲养细胞,如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。
  2.细胞融合的步骤
  (1)制备饲养细胞层:一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。
  与免疫小鼠相同品系的小鼠,常用BALB/C小鼠,6~10周

  拉颈 处死,浸泡在75%酒精内,3~5min
  ↓
  用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜
  ↓
  用无菌注射器注入5~6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管)
  ↓
  反复冲洗,吸出冲洗液
  ↓
  冲洗液放入10ml离心管,1200rpm/分离5~6min
  ↓
  用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬,调整细胞数至1×105/ml
  ↓
  加入96孔板,100μl/孔
  ↓
  放入37。c CO2孵箱培养
  (2)制备免疫脾细胞
  最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死
  ↓
  无菌取脾脏,培养液洗 一次
  ↓
  脾脏研碎,过不锈钢筛网
  ↓
  离心,细胞用培养液洗2次
  ↓
  计数
  ↓
  取108脾淋巴细胞悬液备用
  (3)制备骨髓瘤细胞
  取对数生长骨髓瘤细胞离心
  ↓
  用无血清培养液洗2次
  ↓
  计数,取得×107细胞备用
  (4)融合
  ①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起,在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次,离心,1200rpm,8min;弃上清,用吸管吸净残留液体,以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略松动。
  ②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG(分子量4000)溶液,边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。
  ③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用,每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
  ④离心,800rpm, 6min。
  ⑤充上清,用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。
  ⑥将上述细胞,加到已有饲养细胞层的96孔板内,每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。
  ⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。
(三)选择杂交瘤细胞及抗体检测
  1.HAT选择杂交瘤细胞    脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后,形成多种细胞的混合体,只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时,由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶,故不能生长繁殖,而杂交瘤细胞具有上述两种酶,在HAT选择培养液可以生长繁殖。
  在用HAT选择培养1~2天内,将有大量瘤细胞死亡,3~4天后瘤细胞消失,杂交细胞形成小集落,HAT选择培养液维持7~10天后应换用HT培养液,再维持2周,改用一般培养液。在上述选择培养期间,杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间,一般每2~3天换一半培养液。
  2.抗体的检测   检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同,选择不同的筛选方法,一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
  常用的方法有:(1)放射免疫测定(RIA)可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。(2)酶联免疫吸附试验(ELISA)可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。(3)免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。(4)其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。
(四)杂交瘤的克隆化
  杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。
  克隆化的方法很多,最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。
  1.有限稀释法克隆
  (1)克隆前1天制备饲养细胞层(同细胞融合)。
  2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干,计数。
  (3)调整细胞为3~10个细胞/ml。
  (4)取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板,每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。
  (5)在第7天换液,以后每2~3天换液1次。
  (6)8~9天可见 细胞克隆形成,及时检测抗体活性。
  (7)将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。
  (8)每个克隆应尽快冻存。
  2.软琼脂培养法克隆
  (1)软琼脂的配制:含有20%NCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640。
  ①1%琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。
  ②0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
  (2)用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。
  (3)按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
  (4)1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
  (5)混匀后立倾注于琼脂基底层上,在室温中10min,使其凝固,孵育于37℃、5%CO2孵箱中。
  (6)4~5天 后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。
  (7)检测抗体,扩大培养,必要是地再克隆化。
(五)杂交瘤细胞的冻存与复苏
  1.杂交瘤细胞的冻存   及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则可因上述意外而前功尽弃。
  杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样,原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以装一支安瓿冻存。
  细胞冻存液:50%小牛血清;40%不完全培养液;10%DMSO(二甲基亚砜)。
  冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
  2.细胞复苏方法  将玻璃安瓿自液氮中小心取出,放37℃水浴中,在1min内使冻存的细胞解冻,将细胞用完全培养液洗涤两次,然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内,置37℃、5%CO2孵箱中培养,当细胞形成集落时,检测抗体活性。
(六)单克隆抗体的大量生产
  大量生产单克隆抗体的方法主要有两种:
  (1)体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液内抗体含量为10~60μg/ml,如果大量生产,费用较高。
  (2)体内接种杂交瘤细胞,制备腹水或血清。
  ①实体瘤法:对数生长期的杂交瘤细胞按1~3×107/ml接种于小鼠背部皮下,每处注射0.2ml,共2~4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10~20天)则可采血,从血清中获得单克隆 抗体的含量可达到1~10mg/ml。但采血量有限。
  ②腹水的制备:常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠,1~2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,接种细胞7~10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中,一般一只小鼠可获5~10ml腹水。也可用注射器抽提腹水,可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5~10mg/ml,这是目前最常用的方法,还可将腹水中细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。
(七)单克隆抗体的鉴定
  对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的,应做下述几个方面的鉴定:
  1.抗体特异性的鉴定   除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外,还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验,方法可用ELISA、IFA法。例如:①制备抗黑色素瘤细胞的McAb,除用黑色素瘤细胞反应外,还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应,以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体,应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应,其次是与其它细胞因子间有无交叉。
  2.McAb的Ig类与亚类的鉴定  一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM,则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。在作双扩试验时,如加入适量的PEG(3%),更有利于沉淀线的形成。
  3.McAb中和活性的鉴定    用动物或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如,如果确定抗病毒McAb的中和活性,则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞,来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。
  4.McAb识别抗原表位的鉴定  用竞争结合试验,测相加指数的方法,测定McAb所识别抗原位点,来确定McAb的识别的表位是否相同。
  5.McAb亲合力的鉴定  用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲合力。

单克隆抗体制备的试剂配制编辑本段回目录

1.RPMI-1640培养液  取1640粉10.5g加水1 000ml加温溶解(不要超过50℃)立即用G6漏斗过滤,分装,冰冻保存。
2.DMEM培养液
13.38g干粉溶于1 000ml水中,并加下列试剂:
    丙酮酸钠                           0.11g
    碳酸氢钠                           3.60g
    青霉素                             20万U
    链霉素                             20万U
培养液用CO2正压除菌过滤,使变酸呈橙色,加入20%的新生小牛血清后即可使用,4℃保存。
3.HAT培养液
DMEM培养液490ml,加HT和A各5ml。
100×HT的配制:
次黄嘌呤(H)—胸腺嘧啶核苷(T)
称取次黄嘌呤136.1mg和胸腺嘧啶核苷38.8mg溶于100ml水,过滤除菌-20避光保存。
100×A的配制:
氨基喋呤(A):称氨基喋呤1.8mg溶于20ml水中,加0.5ml 1Mol/L NaOH助溶,然后以0.5ml 1Mol/L HCl中和,再加水至100ml。
4.HT培养液
500mlRPMI-1640液加HT母液5ml即可。
5.完全RPMI-1640液:
   RPMI                     495.0ml
   Hopes缓冲液(1Mol/L)     10.5ml
   L谷胺酰胺                  5.0ml
   抗菌素液                    5.0ml
   灭活小牛血清               50.0ml
6.以上配试剂用水均为双蒸馏水。

动物的选择与免疫编辑本段回目录

(一)动物的选择
    目前应用最广的是小白鼠和大白鼠,尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/c小白鼠应用最广,因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的,雌雄均可,以8~12周龄为宜。
    大白鼠也可,能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上,发展了小鼠-大鼠,小鼠-人以及人-人杂交瘤技术。
(二)免疫
    一般而言,抗原的纯度不很重要,特别是免疫原性较强的抗原。
    免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。
    正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞,一只纯种小白鼠估计能产生1.0×107~5.0×107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合,只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会,必须加强免疫,使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。
    B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合,而免疫以后7~8天,虽然是抗体产生的高峰时期,但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。
    1.可溶性抗原(蛋白质)  以1mg/ml~5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化,分多点小鼠皮下注射,总量为0.3ml~0.6ml,间隔3~5周再同样注射一次,10天后,断尾取血一滴,测抗体效价,选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉(尾静脉)给予无佐剂抗原0.2ml~0.4ml,3~4天后,杀死小鼠取脾做融合用。
 2.颗粒性抗原  如抗原来源方便,可以不加佐剂而增加免疫次数,缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠,以1%浓度每只皮下注射0.2ml,每周2次,共免疫5~8次,取脾前3天,再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大,大到近于免疫耐受的程度更好。

细胞的选择编辑本段回目录

(一)脾细胞
    1.材料
(1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。
(2) 1640培养液
(3) 2.5%FCS-1640营养液
2.操作方法
(1) 拉颈或用CO2处死小白鼠。
(2) 将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾。
(3) 把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。
(4) 用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中。
(5) 直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中。
(6) 以2.5%FCS—1640充满离心管,并以400g离心7min~10min(与此同时应开始制备骨髓细胞)。
(7) 把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。
(8) 重复⑹、⑺步骤。
(9) 计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80%为合格。
(二)骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响或降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。
选择骨髓瘤细胞的条件:①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者的组织相容性抗原一致;②骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外;③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml;④生长速度快,繁殖时间短。
目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有:①S194/5XXO•BU•1;②SP2/0—Ag14(简称SP2);③P2—X? ¬—Ag8•6•5•3(简称653);④FO
以653最为常用,它是由矿物油4-甲基-15烷(Pristane,降植烷)诱发出来的一种浆细胞瘤(Minerol Oil plasmacy toma,MOPC)并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。
骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可。
由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象,在融合前,可将培养基内加入15μg/ml 8-氮鸟嘌呤。取约1×107~6×107对数生长期(即培养15h~20h)的骨髓瘤细胞,在室温离心(400g)10min,沉淀以2.5%FCS—1640液再悬浮并计数。
(三)饲养细胞
在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞(Feeder cell)。在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是:一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等。
1.材料
(1)小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只。
(2)11.6%蔗糖溶液(经10磅30min高压灭菌)。
2.操作方法
(1)拉颈处死小鼠。
(2)70%酒精浸泡消毒10min。
(3)用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔。
(4)用注射器将4ml 11.6%蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体,加入离心管。
(5)1 000r/min离心10min。
(6)取上清,以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞,使每毫升含40万个活细胞。
(7)以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔0.05ml,含2万个细胞,放入CO2培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少,则可以在细胞换液时再加入一些。

细胞融合编辑本段回目录

(一)融合剂
细胞融合的方法有物理法,如电融合、激光融合,化学融合法和生物融合法,如仙台病毒,此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。
聚乙二醇(PEG),在分子量为200~700时,呈无色、无臭的粘稠状液体,分子量大于1 000时,呈乳白色蜡状固体,能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂,对热稳定,与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4 000者,常用浓度为50%,pH8.0~pH8.2(用10%NaHCO3调整),分子量小的PEG,融合效应差,又有毒性,分子量过大,则粘性太大,不易操作。50%浓度,pH偏碱时融合效应最高。
也有采用30%~50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。
不同批号的PEG,即使分子量相同,但融合率却有明显差异,选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的,一般选供气相色谱用的PEG。
(二)融合过程
融合的方法很多,常用的有转动法和离心法。
融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。
1.试剂与材料
(1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
(2) 1640培养液100ml。
(3) 完全1640液100ml。
(4) 2.5%FCS-1640液50ml。
(5) HAT培养液100ml。
(6) 50%PEG:取分子量4 000,高纯度的(日本进口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌,使用前用预热于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合,以酚红检查pH,一般不必调pH。如pH有改变,可用HCl或NaHCO3调整。
(7) 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。
(8) 40孔塑料培养盘。
2.操作方法
⑴ 准备好脾细胞。
⑵ 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞,并加入50ml 2.5%FCS-1640液。
    ⑶ 室温400g离心3min,使细胞沉淀。
    ⑷ 移去上清液。
    ⑸ 轻敲管底部,使沉淀流动,把沉淀管放于40℃水浴中,使其达融合温度。
    ⑹ 加预热至40℃的50%PEG 0.8ml,用1ml吸管缓慢滴加,边加边摇沉淀管,肉眼观察可见有颗粒出现,滴加过程要求持续2min。
    ⑺ 加1ml1640液,边加边摇动,持续1min。
⑻重复⑺一次。
⑼ 加1ml 1640液,边加边摇动,持续0.5min。
⑽ 重复⑼一次。
⑾ 加1640液15ml。
⑿ 室温,400g离心1min,使细胞沉淀。
⒀去上清,轻敲管底部,加25ml含有HAT的完全1640液。
⒁ 往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液,每孔1滴(约0.05ml)。
⒂ 轻摇后,放入5%CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。
⒃ 第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液,勿将固定于孔底的细胞吸出,根据需要加入适量的饲养细胞。
⒄ 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察,大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现,但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后,吸取上清液,检查抗体。
⒅ 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中,依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS-1640液。同时保存于液氮和进行克隆化,在这期间每代都要检查抗体,以防止产生抗体细胞的变异和丢失。
(三)细胞融合的关键
1.技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。
2.融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。

抗体检测及杂交瘤细胞的选择编辑本段回目录

(一)抗体检测
用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多,从沉淀反应到放射免疫测定。由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的,而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。杂交瘤产生的抗体则是单克隆的,所以并不是每项方法都能适用。一定要选择敏感的、快速的、一次又能检测多份样品的方法。常用的检测方法如下:
1.试管溶血反应检测法
(1)材料:①杂交瘤细胞,换液后至少两天才收取培养液;②绵羊红血球,洗涤三次后,配成1%悬液;③豚鼠补体,无菌采取补体,以pH7.2PBS稀释成20%溶液,分装小瓶,于﹣40℃保存。使用时以补体和压积红血球5:1(V/V)的量进行吸收,4℃30min,然后2 000r/min离心10min,去红血球,取上清液备用;④0.01Mol/L pH7.2PBS液。
(2)操作方法:①在小试管中,加入0.1ml杂交瘤细胞用过的培养液,再加入0.1ml pH7.2的PBS液,然后倍比稀释至一定的稀释度;②加入0.1ml补体和1%绵羊红血球0.1ml,混匀后置37℃水浴1h;③观察结果,以绵羊红血球完全溶解的杂交瘤细胞培养液的最高稀释倍数为抗体的溶血效价。
 2.斑点检测法  抗红血球表面的单克隆抗体与浇灌在琼脂板的红血球结合,进而结合补体,而发生溶血斑点,对着光源用肉眼即可判定。
(1)材料:①绵羊红血球,处理同试管法,最后配成25%红血球悬液;②新鲜豚鼠血清(同试管法处理);③琼脂糖,配成0.6%PBS液,水浴中溶化;④0.01Mol/L pH7.2PBS液;⑤兔抗羊红血球抗体。
(2)操作方法:①将溶化的0.6%琼脂糖倒入一试管中,置45℃~48℃水浴中;②加0.1ml 25%红血球悬液,0.1ml豚鼠补体,迅速混匀,倾注一干净载玻片上;③ 凝固后,在凝胶表面固定区域滴加2ml待测样品,标准阳性血清和对照试液;④待溶液全部渗入凝胶后,置湿盘;⑤37℃温育1h~2h,观察并判定结果。
        强阳性(+++)    中等阳性(++)
        弱阳性(+)       阴性(﹣)
必要时可置室温过夜,再判定一次。
3.膜荧光检测法
(1)材料:①培养液HEM或RPMI-1640;②荧光试剂:异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠免疫球蛋白;③50%甘油缓冲液:1份甘油加1份体积0.05Mol/L pH 7.2 PBS 液混合即成;④荧光显微镜、载玻片、盖玻片、吸管等。
(2)操作方法:①用培养液洗涤二次细胞,悬浮成2.0×107/ml;②50µl细胞悬液加50μl培养上清液混合,置4℃30min,用培养液洗涤3次,1 000r/min离心;③以50µlFITC—抗小鼠免疫球蛋白重新悬浮压积细胞,水浴30min~60min;④用冷培养液洗3次细胞,重新悬浮;⑤取一滴细胞悬液滴在玻片上,复盖片,用甘油缓冲液封固,置荧光显微镜下观察。着色细胞也可以在固定后观察,一滴细胞悬液,涂片、风干,用95%酒精固定10min,固定后的载玻片用PBS洗涤,盖上盖玻片,进行观察。
4.免疫球蛋白和亚类球蛋白的检测  以琼脂双扩散试验法进行,此法简单易操作,特异性好。注意必须将培养液浓缩10~50倍,否则做双向琼扩不出现沉淀线。其检测方法为:
(1)制备各种兔抗小鼠IgG1~4、 IgM1~2、IgA1~2和K、λ抗血清,也可直接购买。
(2)取5ml培养物的上清液缓慢加入0.5ml的饱和硫酸铵溶液,混匀,静置3h,离心沉淀,去上清,沉淀加0.05ml蒸馏水溶解。
(3)制成1%琼脂糖凝胶板,打孔。中间孔加20μl浓缩上清液,周围孔加20µl特异性抗血清,以10μl正常小鼠血清作对照。
也可以采用酶联免疫吸附试验、间接血凝试验以及放射免疫等方法检测。
(二)杂交瘤细胞的选择
经HAT选择培养基培养10~14天,未经融合的骨髓瘤细胞相继死去,而杂交瘤细胞即可逐渐长成细胞集落。停用HAT液后,改用HT培养基。当细胞集落面积超过培养孔的1/10以上时,即可用敏感的免疫学方法检测出阳性孔。连续三次检测逐渐升高或维持在同一水平者,则可以做克隆化,一部分则冷藏起来做长期保种用。

克隆化编辑本段回目录

经过抗体测定的阳性孔,可以扩大培养,进行克隆,以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长,互相争夺营养和空间,而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早,太早细胞性状不稳定,数量少也易丢失。
克隆化的阳性杂交瘤细胞,经过一段时期培养之后,也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失,使部分细胞丧失产生抗体的能力,所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说,免疫性强的抗原克隆次数可少一些,但至少要3~5次克隆才能稳定。
克隆化的方法很多,包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
(一)有限稀释法
1.材料
(1)微量培养盘,盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞(即饲养细胞)每孔2万~4万。
(2)HT培养基
2.操作方法
(1)取出抗体阳性孔细胞,用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色,计数。
(2)用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。
(3)用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘,每孔0.05ml,细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。
(4)5%CO2饱和湿度,37℃培养。
(5)每天用倒置显微镜观察克隆生长情况,选择只有一个集落生长的孔,弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。
(6)克隆大量繁殖后,布满孔底的1/3~1/2时,测培养液抗体。
(7)抗体阳性孔细胞,移到有饲养层的组织培养瓶中,并传2~4代就可以脱离饲养细胞,建成克隆株。
(二)软琼脂克隆化
借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长,而达到克隆化,具体操作如下:
1.配2.5%的琼脂糖30ml,水浴溶化后,移入45℃水浴中。
2.将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合,置45℃水浴预热。
3.将琼脂糖与DMEM液混合,即为含0.5%琼脂糖的完全DMEM液,并加75×108 脾细胞。
4.每块平皿加10ml,于室温中凝固。
5.DMEM中的细胞与DMEM—琼脂1:1混合,将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上,使其全部覆盖。
    6.放入CO2箱饱和湿度,37℃培养10天。
    7.用PBS配制0.6%琼脂糖,于沸水浴溶解后,置45℃,在保温情况下取一试管,迅速加入0.1ml 25%羊红血球,0.2ml豚鼠补体,2.7ml 0.6%琼脂糖。
    8.用3ml琼脂糖—羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围,可筛选抗羊红血球Ig。
    (三)显微镜操作法
    在直径6cm培养皿中,加入1ml 1.0×108细胞悬液放置5%CO2饱和湿度,37℃温箱中放置30min以上,倒置显微镜下,寻找那些与周围相距甚远的单个细胞,将毛细管口(一头有直角弯头毛细管,一头连接一尺长乳胶管,用口控制液体进入)水平置放于液面上,左右微动,直到看见管口,对准细胞,吸入毛细管,将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内,培养后,即可获得单个细胞形成的克隆。
(四)荧光激活分离法
用一种荧光激活细胞分类器(Fluorescein Activafed Cell Sorter,FACS)。其基本原理是:将细胞经荧光抗体染色后,经喷嘴形成单个细胞的线形液滴,在莱塞光激发下,荧光素发射荧光,此信号由光电倍增管接收,再结合细胞形态大小产生光散射信号,经电脑处理,产生信号并与预定的信号对比,根据细胞荧光强度及细胞大小不同,将细胞分成不同级别,在电场中发生偏离,而分别收集于不同容器中。

单克隆抗体制备编辑本段回目录

    (一)杂交瘤细胞的大量繁殖
    克隆化的细胞可以在体外进行大量培养,收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限,其不能超过特定的细胞浓度,且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠(无胸腺的裸鼠),杂交瘤细胞就开始无限地繁殖,直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体,这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1 000倍。
    利用免疫抑制剂,如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等,可以加速和促进肿瘤的生长。
    1.材料
  (1)经高压灭菌的降植烷。
  (2)Balb/c鼠:5~8周龄。
    (3)杂交瘤细胞:取对数生长期的细胞。
    (4)RPMI—1640培养液
    (5)新生牛血清
    2.操作方法
  (1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,注射后1~9周内种植细胞。
  (2) 收取对数生长期的杂交瘤细胞,用5%FCS—1640液洗涤一次,1 000r/min离心10min。
    (3) 取样,用台盼兰染色,计活细胞数,重新用5%FCS—1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。
    (4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞,每只腹腔注射1ml(含1.0×107个细胞/ml)。
    (5) 接种后10天左右时间肿瘤体积最大,此时可由腹腔抽取腹水,每隔1~3天取1次,可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。
    (二)单克隆抗体的提纯
    1.材料
    (1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
      20 mMol/L NaCl
    (2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
      40mMol/L NaCl
    (3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
      80 mMol/L NaCl
    (4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
    (5) 饱和硫酸铵液
    (6) DEAE—纤维素柱
    2.操作方法
    (1)小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后,于1.00×105转离心30min,去沉淀。
    (2)在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液,边加边搅拌,使溶液最终为50%硫酸铵浓度。
    (3)此溶液置冰中30min~60min,然后5 000r/min离心10min,去上清。
    (4)将沉淀溶于Tris-HCl缓冲液(40mMol/L NaCl)中(溶液可能混浊)。
    (5)装入透析袋于Tris-HCl缓冲液(20 mMol/L NaCl)中透析除盐。
    (6)离心去沉淀。
    (7)溶液稀释(1:100或更高倍稀释)后,于280nm测蛋白含量,估计蛋白质含量
         1A 280unit=0.8mg蛋白质
           
    一般每ml腹水中,含有总蛋白约25mg~36mg。
    (8)过DEAE—纤维素柱:纤维素柱高40cm,以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。
    样品进入柱床速度为1ml~2ml/min,以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱,也有极少例外的单克隆抗体于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脱。
    测OD280nm收集蛋白峰,单克隆IgG保存备用。
    杂交瘤产生各种免疫球蛋白,但主要是IgG和IgM,究竟是哪种为主,则决定于抗原的免疫程序。免疫一次,且3天后就取脾,多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。
    (三)单克隆抗体的鉴定
    1.杂交瘤细胞染色体的检查  采用秋水仙素裂解法进行。
    2.单克隆抗体的类型、亚型的测定:购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清,采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。
    3.单抗的特异性鉴定  可以采用各种方法,如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等,同时还需做免疫阻断试验等。
    4.单抗的效价测定  可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应,腹水效价可达5×104。而采用ELISA检查,腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。
5.必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。

杂交瘤细胞的保存编辑本段回目录

(一)保存
当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后,必须将一部分杂交瘤细胞保存,否则在连续传代的过程中,可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中,难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下:
1.材料
(1) 细胞:取对数生长期的细胞。
(2) 10%二甲基亚砜保护液(二甲基亚砜能损坏滤器,而又被高压所破坏,所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品,无菌):含10%二甲基亚砜、20%灭活胎牛血清,70%RPMI—1640液。
(3) 20%FCS—1640培养液:含青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml。
(4) 灭菌的2ml安瓶等
2.操作方法
(1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液,加入10%FCS—1640液,使细胞悬浮。
(3) 1 000r/min离心10min,去上清。细胞沉淀用10%二甲基亚砜保护液制成悬液,使成1.0×107细胞/ml。
(3) 取样,台盼兰染色,计数活细胞,应在95%以上。
(4) 用注射器将细胞分装安瓶,每瓶0.5ml~1.0ml,熔封安瓶。
(5) 放4℃ 2h。
(6) 放液氮罐气态部分(-70℃)15h。
(7) 转入液氮部分。
(二)复苏
1.从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。
2.无菌操作打开安瓶,取出细胞悬液,转入组织培养瓶。
3.逐滴缓慢加入20%FCS-1640培养液3.5ml,这个过程延续3min。
4.5%CO2饱和湿度,37℃培养。
5.4h后弃去培养液上清,加入新鲜的20%FCS-1640培养液。
6.继续培养,换液,以至形成单层。

单克隆抗体的杂交瘤技术编辑本段回目录

(一)杂交瘤细胞制备的操作程序
1、骨髓瘤(浆细胞瘤)突变缺陷细胞株的培养和选择
(1) 常用细胞株为SP2/0和NS-1。

表  常用骨髓瘤细胞株的特点
名  称 全  名 特  点 来  源
SP2/0 SP2/0-Ag14 不产生Ig BALB/C小鼠浆母细胞瘤
NS-1 P3-NS-1-Ag4/1 产生K轻链非分泌型 BALB/C小鼠浆母细胞瘤
FO Fast-Zero 不产生Ig BALB/C小鼠浆母细胞瘤
Y3 Y3-Ag1.2.3 产生K Lou大鼠骨髓瘤
SKO-007  产生λε 人浆细胞瘤
TM-HZ  产生λK 人浆细胞瘤
(2)骨髓瘤细胞的培养 骨髓瘤细胞可用10%小牛血清的RPMI1640培养基以悬浮或半贴壁形式生长繁殖,对于半贴壁细胞无需用胰蛋白酶消化,直接用吸管吹打即可使细胞分散,传代培养要保持细胞的对数生长期,每3~5天传代一次。
用于融合试验前必须做对HAT选择培养基敏感性试验,由于HGRPTase缺损,DNA合成障碍细胞,应发生死亡,否则有变异,不能用于试验。以SP2/0细胞为例,应在筛选建株时应用的8-氮鸟嘌呤致死剂的培养液中(20~30mg/L)培养一代后,换成常规培养基培养。
2、免疫脾细胞的制备
     (1)免疫动物
下面以鼠源McAb为例系统介绍McAb技术的原理和方法。
① 动物免疫的原理和策略
      特异性抗体的类型以及与抗原结合的形式都受到免疫形势的影响,这就要求在免疫时要十分注意方法和技术。首先是尽量提高免疫应答反应。通常免疫应答反应在不同的免疫动物之间有很大差异,甚至同一种动物不同的个体也有不少区别。可通过一些措施提高动物的免疫应答反应,除了选择好的动物种类,如BALB/C小鼠;适当免疫佐剂和合理的免疫程序以外,最重要的是要有一个好的免疫原。抗原是制备McAb的第一要素,它的纯度和免疫原性是决定免疫反应的关键。根据抗原的大小和溶解特性可分为颗粒性抗原和可溶性抗原两类。通常抗原越大,结构越复杂,在免疫动物体内存留并作用的时间越长,它的免疫效果越佳。
     以制备鼠源McAb为目的小鼠免疫,没有一个固定的程序,它和制造抗血清有一定的差别。小鼠免疫的目的不是要求血清中含有很高的抗体效价,也不需要免疫细胞产生很强的防御活性。它的目的是产生足够多的B淋巴细胞以满足细胞融合的需要。其中能识别目的抗原的B淋巴细胞越多,筛到阳性杂交瘤的机会就越大。
② 动物免疫程序
近年来人们摸索出了很多新的免疫方案,根据抗血清中的抗体效价的变化,Rathjen(1986)把小鼠免疫的进程划分为5个阶段:1)前期反应;2)初级上升阶段;3)初级回落阶段;4)次级上升阶段;5)次级回落阶段。试验证明,能很快就进入次级免疫反应阶段的小鼠经过细胞融合后多数能获得满意的克隆,为了更好地掌握免疫的时机,必须在第2阶段,尤其是第4阶段后连着3天进行静脉加强免疫,第4天进行融合,可使抗体效价达到最佳状态。
通常一个好的免疫程序一般需要3~4个月时间,在适当的时间进行抗原注射,可使对抗原有特异性的B细胞不断增殖。被刺激过的特异性的B细胞可在适当的时候由脾脏中大量分离获得,这个时机应为B细胞分泌抗体最旺盛的阶段,这一阶段分离到的B细胞和骨髓瘤细胞融合后,会使杂交瘤的克隆总数和阳性克隆数大大增加。
③ 动物免疫方法
      腹腔免疫注射根据经验对大多数抗原来说能够满足要求且方法简单,爪垫注射如果和佐剂(CFA/IFA)共同使用,往往会引起发炎和肿胀;静脉注射,不仅技术上难以掌握,操作困难,而且对有些小分子可溶性抗原小鼠会产生免疫耐受性甚至还有致命的危险。因此,除非特殊需要,通常静脉注射只用来加强免疫,对脾脏直接进行抗原注射可以大大减少抗原的用量,Spitz(1984)用少于20μg的蛋白质抗原和2.5×105细胞抗原直接对脾脏免疫,发现效果比上述几种方法都好。目前通常采用动物免疫法。
 (2)制备免疫脾细胞悬液:通常在末次免疫后第3~4天以拉颈或断头处死小鼠,用75%酒精浸泡消毒小鼠毛皮。然后打开腹腔无菌取脾,去除脂肪和结缔组织,用无血清的培养液冲洗,置100目不锈钢网筛上研磨脾脏,用洗液洗2~3次,经1000r/min离心5分钟,弃上清加入完全培养基,用吸管吹打分散,收集上层悬液,除去沉下的大块。活细胞计数,一般一只小鼠可获1~2.5×108脾细胞。
3、饲养细胞的制备
为防止细胞融合时因损伤而难以生长,促进杂交瘤细胞生长,增加克隆数,常需制备饲养层细胞。可用肉汤刺激小鼠腹腔并收获腹腔中的巨噬细胞供饲养层用,该细胞有助于清洁培养表面和吞噬死亡细胞。
用吸管在打开的腹腔中吸取细胞悬液,并用培养液冲洗收获,离心洗一次,再用培养基(含HAT)调整细胞至2×105/ml,包板培养,96孔板0.1ml/孔即可,每只鼠可获巨噬细胞2~5×106个细胞。
4、HAT培养基的制备
(1)[HT贮备液制备×100] 次黄嘌呤(Hypoxanthine;H)/ 胸腺嘧啶核苷(Thymidine;T),简称HT
① 称取136.1mg H;38.8mg T;
② 依次溶解在100ml双蒸水中;次黄嘌呤难溶,可加温50∽80℃促溶;
③ 用0.22μm微孔滤膜过滤除菌,每瓶分装2-5ml,-20℃冻存,临用前用培养基稀释100倍。
(2)[A贮备液制备×100] A为氨基喋呤(Amiropterin;A)
① 称取17.6mg A加至90ml双蒸水中;
② 滴加1N NaOH溶液并不断摇动,直至完全溶解,再滴加等量1N HCl溶液,恢复pH至7.0左右;
③ 补足双蒸水至100ml;
④ 0.22μm微孔滤膜过滤除菌,分装,-20℃冻存.
(3)HAT培养基制备
临用前,于每100ml RPMI1640培养基中(含10%小牛血清或牛血清)加1ml HT贮备液和1 mlA贮备液。
(二)细胞融合试验
聚乙二醇(PEG)诱导细胞融合法:PEG结构为HOH2C(CH2OCH2)nCH2OH,分子量从小于200至大于6000,均可作细胞融合剂。通常用分子量1000或4000的PEG作融合剂,50%溶液产生最多杂种细胞,若用分子量较小的PEG时,以55%浓度为好。PEG在pH6.0时细胞融合率最高,融合时细胞密度不要太大,常采用微孔膜过滤除菌,因高压灭菌会产生有毒醛类化学物。具体步骤如下:
(1) 将两种不同亲本细胞以10:1或5:1混匀,即作单克隆抗体杂交瘤细胞融合试验时,取107个免疫脾细胞加入108个SP2/0(或NS1)鼠骨髓瘤细胞,混匀后低速(200g)离心去上清,叩松沉淀细胞。
(2)在37℃水浴中边摇边滴加0.7ml预热的50%PEG(MW1000或4000),于一分钟内滴完。
(3)于2分钟内加入15ml预热的无血清1640培基,以终止融合,1000r/min离心去上清,沉淀细胞悬浮于24ml HAT培基中。
(4)将细胞分种于含饲养细胞的24孔板中,0.5ml/孔,置37℃含5%CO2的培育箱中培养,每3~4天半量换HAT培养,15天后改用HT培基,3周后改用完全RPMI16403培基。
(5)培养3~5天即可有小克隆出现,杂交细胞较大,呈园形,且透明,其它细胞透光性差并逐渐死亡。
(6)培养8-12天,克隆可长至底面积的1/3~1/2,此时可取培养上清液,进行抗体检测。
(7)一旦检测到分泌预定抗体的克隆,应及时将阳性克隆转入培养瓶扩大培养,冻存部分克隆细胞,并尽快进行克隆化培养。
(三)单克隆抗体检测
克隆一旦形成,应及时选择灵敏、特异、快速、稳定、可靠的免疫学方法,如免疫荧光试验,以免非特异阳性克隆掩盖特异的阳性克隆。免疫印迹(Western  blooting)ELISA酶试验,放射免疫试验,筛选分泌预定抗体的杂交瘤细胞克隆。
根据不同的抗原类型选用不同的检测方法。若为可溶性抗原,先选用已知抗原包板,并用小牛血清或牛血清白蛋白封闭后,采用ELISA法测定,也可用放射免疫法测定(RIA)。若为细胞膜表面抗原可采用膜萤光免疫测定法、细胞毒试验、细胞酶免疫测定法。若为细胞膜表面可溶性抗原,可用免疫印迹(Western  blotting)法测定。值得注意的是所有对抗原有特异性的杂交瘤都不能漏检,最常用的初筛检测方法有以几种类型:
①抗原一抗体结合试验:这是一种以抗原与单抗呈特异性结合为原理的测试方法,用同位素(又称核素)、酶、萤光素标记的第二抗体(抗小鼠Ig)或葡萄球菌A蛋白(SPA)进行检定,如果为可溶性抗原,先将抗原包被在96孔板上,使之固定化,若抗原是半抗原等小分子物质,则可将其与蛋白结合后,再包被塑料板。 筛鼠类McAb可用以下三种ELISA或RIA法检测:
1)包被Ab1+鼠McAb+Ag*(Ab1为抗小鼠Ig,Ag*为标记抗原)
2)包被Ag+鼠McAb+Ab1*(Ab1*为标记抗小鼠Ig)
3)包被Ab1+鼠McAb+Ag+Ab2*(Ab1为抗小鼠Ig,Ab2*为标记抗Ag抗体)
②被动血凝试验:将特异性抗原通过化学偶联法结合在红细胞表面作为指示细胞,当与相应特异抗体结合,即可导致红细胞凝聚,它具有简便、快速和灵敏的优点。在此法的基础上,经进一步改进,即在适当稀释的杂交瘤阳性克隆上清中加上过量抗原,再用上述致敏的红细胞(指示细胞)进行检测,则为血凝抑制。改进后的血凝抑制试验是一种检测抗体特异性的简单有效的方法。
③细胞毒试验:该法是测定细胞表面抗原与鼠McAb特异免疫反应的敏感方法,当鼠McAb与靶细胞表面抗原结合形成膜Ag-Ab复合物后,加入适量补体,在补体介导下,使细胞破坏(打孔),以致细胞破裂死亡。可采用染料着色法在显微镜下计数着染的死细胞。也可用51cr释放试验测量细胞51cr量,也可用MTT法,测定细胞琥珀酸脱氢酶活性,在酶标仪上采用测定OD值方式,计算细胞死亡结果,采用这些方法所测定的结果均比较客观、准确。
④细胞性抗原ELISA测定法
    1)制备细胞抗原板:先将贴壁生长的细胞消化制成细胞悬液,接种96孔板,200ul/孔(细胞为105/孔)于37℃5%CO2培养24~48小时,弃培养液,用PBS(pH7.2)洗3次,然后用含1%牛血清白蛋白封板,用塑料袋密封4℃保存,2周内可用。
2)检测抗体时,取出检测板。
3)每孔加0.1ml0.3%H2O2-PBS 37℃放置30分钟,以阻断内源性过氧化物酶。
4)PBS洗3次,每次3分钟。
5)每孔加入有克隆形成杂交瘤细胞培养上清液50ul,37℃孵育1-5小时,或4℃过夜。
6)PBS洗2次,洗涤液(PBS中含0.1%小牛血清、0.01%明胶、0.1%牛血清白蛋白、0.05%Tween20和0.01%NaN3)洗2次,每次3分钟。
7)每孔加辣根过氧化物酶标记的兔(或羊)抗小鼠IgG 50ul,[用稀释液(即PBS中含2%正常兔血清和10%甘油)稀释酶标抗体],37℃孵育30分钟。
8)PBS洗5次,每次3分钟。
9)每孔加新鲜配制的0.1ml底物溶液(邻苯二胺20mg溶于50ml pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液,用前加30%H2O2)25℃暗处反应30分钟。
10)每孔加50ml 2mol/L H2SO4,终止反应。
11)判定结果:阴性对照孔应无色,阳性对照孔呈橙黄色,试验孔的颜色与阳性对照孔颜色基本一样,可判定为阳性。此外,也可在酶标仪的490nm波长下测定吸收值。若试验孔的光吸收值大于或等于阳性对照孔的光吸收值,可判定为阳性。
(四)克隆化培养
克隆培养对于获得分泌单一抗体杂交瘤细胞株至关重要,多数情况下在初选的阳性克隆中不是来自单个细胞,可能混有不分泌目的抗体的克隆,它比分泌抗体的克隆长得快,因此尽早进行抗体检测和克隆化培养,避免发生竞争性生长抑制,有时会发生变异不再产生抗体,这就需要再进行3~4次克隆化培养,以保证分泌性克隆生长的稳定性,其目的是利用单个细胞克隆化培养技术从细胞群体中选育出遗传稳定而同源的能分泌特异性抗体的细胞,淘汰非特异性的或遗传不稳定的杂交瘤细胞。克隆化培养有软琼脂培养法和有限稀释法。此外还有单细胞显微操作法、流式细胞仪分离法,其中有限稀释法最常用。方法如下:
(1)制备饲养层:取正常小鼠腹腔巨噬细胞制成细胞悬液,接种96孔板,100ul/孔,含2×104细胞。
(2)用吸管吹打杂交瘤细胞培养板内的克隆、悬浮于完全培养液中。
(3)取样、计数:调整浓度至100、50、10/ml。
(4)分别将三种密度的杂交瘤细胞悬液接种于含饲养细胞的培养板中,每孔加100ul,使每孔分别为10、5、1个细胞。
(5)在37℃5%CO2下静置培养,1周后可半量换液,培养10~14天,取培养上清进行抗体检测。
(6)对阳性克隆再施用克隆化培养,直到100%的克隆分泌特异性抗体为止。同时将阳性克隆进一步扩大培养,冻存。
克隆化培养的具体操作方法和步骤如下:
(1)有限稀释法
    1)将细胞悬液于HT-1640培养液(含10~15%小牛血清)中计数细胞浓度,然后用该培养液稀释至每毫升分别含5、10和50个细胞的细胞悬液。
例如:假设该细胞混合悬液的细胞浓度为3.5×105/ml,可按如下步骤稀释:
取该细胞悬液0.1ml+培养液(HT)3.4ml-----------104cells/ml(A液)
取A液0.1ml+培养液(HT)9.9ml-------------------102cells/ml(B液)
取B液1ml+培养液(HT)1ml------------------------50 cells/ml(C液)
取B液1ml+培养液(HT)9ml------------------------10 cells/ml(D液)
取D液2ml+培养液(HT)2ml-------------------------5 cells/ml(E液)
2)将上述稀释的细胞悬液C、D、E分别加入含有饲养细胞的96孔培养板的小孔中,100μl/孔,使每孔分别含有0.5、1和5个细胞,这种细胞的分布率,常常根据细胞的特性和试验条件而有所不同,对于生长良好的细胞,其分布密度(分布率)可以适当低一些,对于刚融合后的第一次阳性克隆筛选时,孔中的细胞密度要求高一些。
3)培养板在5%CO237oC下培养至第3~4天,在显微镜下,可观察到单细胞增殖情况,(培养当天或第二天板的U型底中开始为单细胞分布,第3~4天细胞数明显增多)。
4)特异性抗体检测,在克隆后的一周至第10天,显微镜下可观察到U型孔底约有1/2~1/3被细胞布满,当孔中细胞数达150~500个细胞时,即可吸出上清液,用各种方法尽快检测相应的特异抗体,可选择抗体效价高,呈单个克隆生长,形态良好的细胞孔,一部分细胞用于扩大培养冻存,一部分细胞可继续按同样的方法再克隆。
为确定所得的杂交瘤细胞为单个细胞克隆,可用下述Poisson公式加以验证:
                        f(0)=e-λ
f(0)为无细胞生长孔,λ为预定的每孔克隆数,e为自然对数的底,e=2.71828
设λ=1,则f(0)=0.3678
由此可知,要得到每孔只有一个克隆的概率,则有37%以上的孔应无细胞生长,如果连续两次克隆化都符合Poisson分布的单个克隆的生长孔数,而且全部克隆生长孔的上清均检测出阳性抗体,就可以认定已得到能分泌均一抗体的单克隆杂交瘤细胞系。
(2)单个细胞显微镜操作法
   基本原则是借助倒置显微镜的观察,用特制的弯头毛细管将单个细胞逐个吸出。
      1)将待克隆化的细胞悬液按5000~10000个细胞/皿,分别加至平皿中,在CO2培养箱中静置1小时。
2)在无菌条件下,将平皿移至倒置显微镜下,去盖,将弯头毛细吸管置于水平位置,直至显微镜下见到管口,将管口对准单个细胞,借助毛细吸管另一端橡皮乳头的吸引力,可将单个细胞吸入管内。
3)轻轻将毛细管抽出液面,将管内细胞移至预先加有饲养细胞的96孔培养板的小孔中。
4)将毛细吸管放在装有细胞培养液的小瓶中,冲洗数次后,再继续吸取其他单个细胞至另外的培养小孔中,直至培养板的96孔中均加有单个细胞,立即将培养板置入CO2培养箱中培养,隔日观察孔中单个细胞生长情况。
   (3)流式细胞仪分离法
现代化的流式细胞仪,不仅可测出流动细胞生理、生化以及其他一些生物学特性,而且还可让细胞以单细胞流的形式通过一束经过聚焦的萤光,每个细胞都可在萤光的控制下显示一个信号,这个信号可以被检测、被放大、被分析,以至被记录下来,然后再借助于另一个设备,根据某一特定的参数,使细胞分离如同邮局拣信件那样被分离开来。
分离细胞时将细胞流通过不断振动,使细胞流变成细小的液滴,并使每个小液滴只含有一个细胞。细胞液滴下落之前,在电极的作用下,使细胞带上负电荷,在液滴下落过程中,经过一个电场,液滴中的细胞由于带负电,自动偏向正极,并下落到下方自动定位并移至培养板的小孔中,使每个小孔能均匀地分配到一个细胞。
这种方法的优点是快速,1~2分钟内即可完成一个96孔板的克隆化,更大的优点是它可以根据不同的参数或指数来定向地分离细胞。缺点是这套装置价格昂贵,不是一般实验室都能拥有。
该仪器功能多样,用途很广,可用于测定细胞活力,凋亡,细胞周期及细胞表面受体分布,还可用于测定特异蛋白,如Ig等。
(五)单克隆抗体的制备
在细胞培养过程中杂交瘤能产生和分泌单克隆抗体,但产量低,约10~100mg/L,为了获得大量高效价抗体,通常采用将杂交瘤细胞植入BALB/C小鼠体内,制备含特异性单克隆抗体的腹水,产量约1-5g/L。此方法尽管可大大提高效价,但较麻烦,要饲养动物,周期长,无法工业化生产,而且也不经济,但目前仍为通用方法。方法如下:
(1)选用BALB/C雌性小鼠(经产鼠更好),在接种杂交瘤细胞前1~2周,先给小鼠腹腔注射0.5ml降植烷或医用液体石蜡,或福氏不完全佐剂。预处理过的小鼠在2~3个月均可使用。其原理是刺激免疫细胞,引起粒细胞、巨噬细胞侵润性炎症,产生一系列的生长因子,以利杂交瘤细胞增殖和抗体的大量分泌。
(2)收集生长良好的杂交瘤细胞,离心洗涤一次,重悬浮于无血清培养液中,调整细胞密度1~2×106/ml,每只小鼠腹腔注射0.5ml细胞悬液。
(3)接种细胞7~12天,可见小鼠腹部明显膨大。消毒腹部皮肤,用带8号针尖的注射器刺入腹腔,卸下注射器,抬高小鼠头部,使腹水滴入离心管中(或小心用注射器抽腹水)一般可收集3~5ml/只。
(4)3000r/min离心15分钟,弃去上层油脂,吸取淡黄色腹水,分装于-70℃冻存备用。此抗体腹水纯度差,若需制成制剂,还需进一步纯化。
(六)杂交瘤细胞的鉴定
对已建立的杂交瘤细胞系不仅要保存好,还应防止变异和污染,特别是要进行染色体检查分析(数目、形态)。
对培养的杂交瘤细胞要作细菌、霉菌、支原体检查,应为阴性。
染色体检查:小鼠脾细胞染色体正常情况下为2n=40,全为端着丝点,小鼠骨髓瘤细胞染色体数目变异较大,如SP2/0细胞为2n=62~68,NS-1为2n=54~64大多为非整倍性,有中部或亚中部着丝点的标记染色体,融合后的杂交瘤细胞染色体数目应接近两种亲本之和,在结构上除多数为端着丝点外,并出现少数标记染色体。
(七)单克隆抗体的鉴定
在建立稳定分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株的基础上,应对制备的单克隆抗体的特性进行系统的鉴定,一般可进行以下几个方面的鉴定。①抗体的特异性和交叉情况;②抗体的类型和亚类;③抗体的中和活性;④抗体的亲和力;⑤抗体对应抗原的分子量;⑥抗体识别的抗原表位。

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一、细胞融合前准备
  (一) 免疫方案
  选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
  1. 颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:
          初次免疫       1×107/0.5ml ip (腹腔内注射)
            ↓ 2~3周后
          第二次免疫      1×107/0.5ml ip
            ↓ 3周后
          加强免疫(融合前三天) 1×107/0.5ml ip或iv(静脉内注射)
            ↓
          取脾融合
  2. 可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂,常用佐剂:福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
      初次免疫  Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射
        │     (一般0.8~1ml 0.2ml/点)
        ↓3周后
      第二次免疫 剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip
        │       (ip剂量不宜超过0.5ml)
        ↓3周后
       第三次免疫 剂量同上,不加佐剂,ip
        │ (5~7天后采血测其效价,检测免疫效果)
        ↓2~3周后
      加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv
        ↓3天后
       取脾融合
  目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原反应性。
  (二) 饲养细胞
  在制备单克隆抗体过程中,许多环节需要加饲养细胞,如:在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞,也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便,照射后可放入液氮罐长期保存,随用随复苏。
     小鼠腹腔巨噬细胞的制备
     小鼠采用与免疫小鼠相同的品系,常用BaLb/c小鼠6~10周龄
      ↓
     拉颈处死 浸泡于75%酒精,消毒3~5分钟
      ↓
     用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜
      ↓
     用无菌注射器注入6~8ml培养液
      ↓
     反复冲洗,吸出冲洗液
      ↓
     放入10ml离心管,1200转/分离心5~6分钟
      ↓
     用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬,调整细胞数1×105/ml
      ↓
     加入96孔板,100μl/孔
      ↓
     放入37℃ CO2孵箱培养
  一般饲养细胞在融合前一天制备,一只小鼠可获得5~8×106腹腔巨噬细胞,若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时,细胞浓度为5×106/ml,小鼠脾细胞为1×106/ml,小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105/ml,均为100μl/孔。
  (三) 骨髓瘤细胞
  骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb。
  常用骨髓瘤细胞系有:NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。
  骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液,如RPMI1640,DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10~20%,细胞的最大密度不得超106/ml,一般扩大培养以1∶10稀释传代,每3~5天传代一次。细胞的倍增时间为16~20小时,上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
  一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞,为确保该细胞对HAT的敏感性,每3~6月应用8~AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次,以防止细胞的突变。
  保证骨髓瘤细胞处于对数生长期,良好的形态,活细胞计数高于95%,也是决定细胞融合的关键。
  (四) 免疫脾细胞
  免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏,制备成细胞悬液,由于此时B淋巴母细胞比例较大,融合的成功率较高。
  脾细胞悬液的制备:在无菌条件下取出脾脏,用不完全的培养液洗一次,置平皿中不锈钢筛网上,用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍,细胞数为2×108左右。
二、细胞融合,选择杂交瘤
  (一) 细胞融合流程
  (1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0,1000rpm离心5分钟,弃上清,用不完全培养液混悬细胞后计数,取所需的细胞数,用不完全培养液洗涤2次。
  (2) 同时制备免疫脾细胞悬液,用不完全培养液洗涤2次。
  (3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起,在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次,1200rpm,8分钟。
  (4) 弃上清,用滴管吸净残留液体,以免影响PEG的浓度。
  (5) 轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略加松动。
  (6) 在室温下融合:
  ① 30秒内加入预热的1ml45%PEG(Merek,分子量4000)含5%DMSO,边加边搅拌。
  ② 作用90秒钟,若冬天室温较低时可延长至120秒钟。
  ③ 加预热的不完全培养液,终止PEG作用,每隔2分钟分别加入1ml,2ml,3ml,4ml,5ml和10ml。
  (7) 离心,800rpm,6分钟。
  (8) 弃上清,先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640轻轻混悬,切记不能用力吹打,以免使融合在一起的细胞散开。
  (9) 根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液,10ml一块96孔板。
  (10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,100μl/孔,37℃、5%CO2孵箱培养。
  一般一块96孔板含有1×107脾细胞。
  (二) HAT选择杂交瘤
  应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到,这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。
  一般在融合24小时后,加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存,用时1ml加入50ml20%小牛血清完全培养液中。
  因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞,200μl/孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为,融合后最初补加的量可用全量的2/3进行选择,可得到满意的筛选结果。
  50×HAT
  H: 5×10-3M
  A: 2×10-5M
  T: 8×10-4M
  一般选择HAT选择培养液维持培养两周后,改用HT培养液,再维持培养两周,改用一般培养液。
三、抗体的检测
  筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中,仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
  检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同,选择不同的筛选方法,一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
  常用的方法有:
  1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。
  2. RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
  3. FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。
  4. IFA用于细胞和病毒McAb的检测。
  上述方法均为一般实验室的常规方法,故在此不介绍具体的实验过程。
  可靠的筛选方法必须在融合前建立,避免由于方法不当贻误整个筛选时机。
四、杂交瘤的克隆化和冻存
  克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。
  (一) 克隆化方案
  用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
  1. 有限稀释法的程序
  ① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
  ② 阳性孔细胞的计数,并调细胞数在1~5×103/ml
  ③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞/ml,100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml,100μl/孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个/ml,100μl/孔,加G、H两排,为每孔0.5个细胞。
  ④ 培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μl/孔。
  ⑤ 第8~9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。
  注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
  2. 软琼脂法
  ① 软琼脂的配制
  含20%FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640
  1%琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。
  0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
  ② 用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。
  ③ 按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
  ④ 1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
  ⑤ 混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中10分钟,使其凝固,孵育于37℃,5%CO2孵箱中。
  ⑥ 4~5天后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
  ⑦ 检测抗体,扩大培养,必要时再克隆化。
 
  (二) 杂交瘤细胞的冻存
  及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃。
  杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样,原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以冻一支安瓿。
  细胞冻存液:
  50%小牛血清
  40%不完全培养液
  10% DMSO(二甲亚砜)
  冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃,再降温时一般按每分钟降温2~3℃,待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃ 后放-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
五、单克隆抗体的大量生产
  大量生产单克隆抗体的方法主要有两种:
  1. 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为10~60μg/ml,如果大量生产,费用较高。
  2. 体内接种杂交瘤细胞,制备腹水或血清。
  ① 实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按1~3×107/ml接种于小鼠背部皮下,每处注射0.2 ml, 共2~4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10~20天)则可采血,从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg/ml。但采血量有限。
  ② 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb/c鼠,1~2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,接种细胞7~10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中,一般一只小鼠可获1~10ml腹水。也可用注射器抽取腹水,可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml, 这是目前最常用的方法,还可将腹水中细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。
六、单克隆抗体的鉴定
  对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:
  1. 抗体特异性的鉴定:除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外,还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验,方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb,除用黑色素瘤细胞反应外,还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应,以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。② 制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体,应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应,其次是与其它细胞因子间有无交叉。
  2. McAb的Ig类与亚类的鉴定:一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时,已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM,则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时,如加入适量的PEG(3%),将有利于沉淀线的形成。
  3. McAb中和活性的鉴定:用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性,则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞,来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。
  4. McAb识别抗原表位的鉴定:用竞争结合试验、测相加指数的方法,测定McAb所识别抗原位点,来确定McAb的识别的表位是否相同。
  5. McAb亲和力的鉴定:用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。
七、影响因素、失败原因分析
  由于制备McAb的实验周期长,环节多,所以影响因素就比较多,稍不注意就会造成失败。
  其主要失败原因和影响因素有:
  1. 污染:包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之,以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清,此外,其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室,要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查,查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法,将污染的杂交瘤细胞注射于BALB/c小鼠的腹腔,待长出腹水或实体瘤时,犖^菌取出分离杂交瘤细胞,一般可除去支原体污染。
  2. 融合后杂交瘤不生长:在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差,用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题,主要是A含量过高或HT含量不足。
  3. 杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体
  ① 融合后有细胞生长,但无抗体产生,可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变,变成A抵抗细胞所致。
  ② 有可能是免疫原抗原性弱,免疫效果不好。
  ③ 对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性,可能是细胞支原体污染,或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长,从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”,可能是防止抗体停止分泌的有效措施。
  三要:
  要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。
  要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。
  要定期进行再克隆。
  三不要:
  不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势,压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。
  不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。
  不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。
  4. 杂交瘤细胞难以克隆化
  可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关,或由于细胞有支原体污染,使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化,应在培养液加HT。

单克隆抗体的大规模生产编辑本段回目录

一、牛淋巴液体外循环培养法
美国Bio-Response公司使用牛淋巴液为杂交瘤细胞的培养基,每头牛都安装有抽取淋巴液的导管,含有营养物质和促进细胞生长的生长因子的淋巴液,经过滤系统,补充氨基酸、维生素、O2和CO2后,再流入中空纤维培养室,80%淋巴液送回牛体再循环,20%流入培养室,含淋巴液营养物质,通过中空纤维的半透膜析出,供杂交瘤细胞生长,细胞所分泌的McAb通过μm级的多孔半透膜流出培养室,每头牛可维持10个培养小室,每天可生产5g McAb,18头牛每年可生产2kg McAb,中空纤维培养室中的细胞经分离后,可进行再培养以增加产量。
二、微囊培养法(Micro-encapsu lation)
美国Damon Biotech公司使用该法大规模生产McAb成功地用于鼠-鼠,人-鼠或人-人杂交瘤。其方法是将杂交瘤细胞悬浮于藻酸钠溶液内,通过成滴装置使该细胞悬液滴入CaCl2溶液中形成凝胶小球,细胞被固定化。先用L-赖氨酸洗涤,再用聚乙烯胺溶液在界面形成半渗透膜。将此微球悬浮于液体培养基中,营养物和废物可通过微囊的膜,分泌的McAb则积累在微囊内。培养一段时间后,从培养液中分离出微球,冲洗微球后打开囊膜,离心分离即可获得高浓度的McAb。该法比悬浮培养法更好,前者产量为90μg/106细胞,后者仅为100~200ng/106细胞,前者纯度为总蛋白的52%,后者则不到1%,1000L的培养液(细胞密度为1.1×107/ml),即可生产1kgMcAb,相当于5万只小鼠的产量,其优点:(1)从微囊中收集的McAb含量高,可使人McAb的产量提高30~100倍。纯度也比其他方法高,且具提纯程序简单,成本极低的优点;(2)扩大了杂交瘤细胞贴附的表面积,发酵罐容量和培养液的需要量相对减少,工厂占地面积也随之减少,Damon公司年产数公斤的McAb,而新厂房面积只有464.5m2,工作人员仅15~20人。
三、含血清的杂交瘤细胞大量培养法
为了大量制备McAb,可采用装有搅拌器或气泡搅拌的250L、500L、1000L发酵罐中体外大量培养杂交瘤细胞。这种发酵法的大罐悬浮培养其优点是易于操作,也有人改用一种连续灌注的培养系统,罐内放置一块10μm滤片,用于截留细胞,其细胞生长浓度比常规培养高10倍以上(1~2×107/ml)。由于不断加入新鲜培养基,所得滤液的McAb浓度可提高10倍以上,达到500μg/ml水平。
Amicon公司采用Vitafiber中空纤维组成的超滤系统,在大罐内装有中空纤维(其膜的截留阀为1~5万道尔顿)组成的超滤装置,在超滤膜外室间培养细胞,培养液通过中空纤维不断循环,依此膜交换细胞的营养物质和废物。在此培养系统中可使杂交瘤细胞生长浓度高达108/ml,培养液中McAb浓度可达6mg/ml,其中血清含量仅需用1~2%,不仅可降低血清消耗的成本,而血清含量低,也利于纯化。此法生产的McAb纯度比腹水中McAb高两个数量级。
四、无血清的杂交瘤细胞培养法
采用无血清培养基培养杂交瘤细胞所生产的McAb,利于McAb的提纯。该培养基可以根据无血清培养基的配方自行配制,也可从市场上购置已配制好的无血清培养基。
五、工业化悬浮培养生产McAb的工艺流程
工艺流程中配料罐1内配制培养液,经无菌过滤后送入贮液罐2,灭菌后送入平衡罐3,调整氧化还原电位至75~100mv,以提高细胞繁殖速度及生长密度,可再输入种子罐4和主培养罐5,也可供培养罐换液和扩大培养时使用。细胞先在种子罐中培养达饱和密度或对数生长期时,由4号罐将大部分细胞打入5号罐,再由3号罐加液至4号、5号罐,种子罐继续保种,主培养罐可进行生产,由5号罐培养的细胞达到生产目的后,细胞悬液进入收集罐6,经离心机7离心收集细胞,可供提取物质、上清液若作为目的产品液可供收集提取产品,若纯属代谢废物也可作废物处理后排放,此系统中各部件均用带软管的快速接头构成直接连接系统,使设备之间均能及时分离和灭菌,此外种子培养罐与主培养罐系统均需配备检测温度、搅拌速度、CO2/O2、氧分压、pH等检测和自动控制装置,以检测和控制培养过程中的温度、压力、溶解氧、CO2浓度、氧化还原电位、搅拌速度、通气量、营养成分以及细胞密度等参数。
动物组织中的细胞密度约为109个/mL,为自然界细胞所处最高密度状态,而体外悬浮培养的细胞密度一般在5×106个/mL以下,要提高细胞产量,需扩大培养规模,规模越大则控制越困难。现采用灌流培养法是较为有前途的技术,其流程包括培养基供给,培养罐、细胞及培养液分离系统,培养液连续收集装置,在上述检测和控制系统的监控下,细胞密度可达107个/mL,为一般悬浮培养法的10~100倍,更重要的是培养容量甚至可放大100~1000倍。
2、悬浮培养条件控制
动物细胞生产不如微生物快,而且又具有锚地依赖性,容易聚集成团,因此培养时为严格控制和防止污染,除反应器密封性能良好外,尚需添加抗生素,而且培养器管等及接头处的材料应为无毒性物质(通常为不锈钢材料)。其温度、溶解氧、pH变化对细胞生长影响明显,敏感性强,要求控制系统灵敏、精密。通气量和搅拌速度快对细胞不仅有机械损伤,而且有气泡产生而影响细胞生长。若加入抗泡沫剂,有可能有毒性,尽量不加。通常控制一定气量和搅拌速度,通过改变空气中氧浓度来控制溶氧量,PH的调节常通过加入NaHCO3或通入CO2气来进行调节。

 


 

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