1、认真按照操作规程进行实验，一般不大会导致污染，很多情况下是由于所用的试剂或培养基有污染而使实验失败，

2、粉末培养基配制好后 ( 加了血清 ) ，一般在 4 度尽量不要超过 1 个月，如在 -20 度 存放时间 可长一些，但最好也不要超过 3-4 个月，可能对于永生化细胞株来说要求不是太高，但我在过去的 4 年里一直是作原代细胞培养的，细胞娇弱，经验表明放置时间不宜过长。

3、关于实验用品的清洗与消毒，我的经验是：用过的玻璃器皿先在清水中浸泡 30min 以上，然后加少许清洗剂，以超声波洗涤 30min 左右， ( 如无超声波洗涤器可用软毛刷轻轻刷洗干净 ) ，捞出晾干，再在铬酸洗液中浸泡 6-18h( 或过夜 ) 后，自来水清洗 10-15 遍，双蒸水清洗 3-4 遍，晾干，高压消毒后即可使用。

许多塑料制品也可以高压消毒，例如培养瓶盖，胶塞，吸头等。不能用于高压的一般均已制成一次性作用的商品了，当然如果 money 有限，如进口的培养板、皿等，也可以重复使用 1-2 次，我当时使用方法是将其完全清洁后，使用前在紫外灯下敞开照射 1-1.5h 即可，我做过多次，没有出现问题。塑料培养瓶由于清洗消毒不便，最好不要重复使用，如一定要重复用，可用环氧乙烷等消毒， ( 消毒后一定要放置半年以上方可使用 )

在光镜下，上皮细胞通常呈 “ 铺路石 ” 样排布，细胞之间有拉丝现象（即距离较远的细胞可以通过细长的触手相连），细胞有成片生长的特性。而间质细胞通常呈梭形，没有有成片生长的特性，细胞之间的联系不紧密。但是细胞的形态特征会因为生长条件的改变而改变，如 HeLa 细胞是上皮细胞，但是在酸性培养条件下会变为梭形。

上皮细胞之间都有特征性的紧密连接（桥粒）结构，因此可以通过观察培养细胞的超微结构来判断细胞的类型，如果有紧密连接，就必然是上皮细胞。这是一锤定音的证据。注意不要把细胞消化下来做电镜，要用细胞刮刮下来后做电镜。

此外每一种上皮细胞都有其特征的细胞角蛋白的表达（ cytokertin, CK ） , 可以查一下子宫内膜腺上皮细胞表达的 CK 分子，然后进行免疫细胞化学的鉴定。

细胞在偏碱的情况下培养，耐受能力会逐渐下降，可能是产生脱壁现象的原因，后来我重新测了一下培养基，为 7.5 左右，我用灭菌的 HCL 调了一下，培养基颜色变成淡红透亮，再次培养，发现细胞贴壁比较好了，搏动效果也不错，因此，我以后每次培养前都要重新调好 PH 值，我觉得很多因素是能影响 PH 值的。

血清质量不好，影响了细胞生长。所以，我认为以后养细胞，用的血清浓度最好是每批次血清都摸一下，不一定要以参考文献为准，毕竟国产的血清质量差异比较大啊。

细胞无菌操作是关键，对于配制培养液时，有些人为了让培养粉充分溶解，搅拌 4 小时或更长时间。其实这完全没有必要，一般培养基的固体组分还是易溶于水的，搅拌的时间长了会增加污染机会，虽然后来滤过除菌了，但细菌的代谢产物比如脂多糖谁能够把它滤掉？细菌的代谢是很快的，甚至在常温下 20min 就可以繁殖一代，太可怕了。我的经验就是搅拌 30min-60min 就把它过滤。

另外关于培养基的 pH 问题，一般按照说明书操作，加入所说的 NaHCO3 量，与预计的 pH 不会有什么距离，也就是说基本上不用调 pH ，如果相差大，要考虑三蒸水的质量是否有所下降，当然这时调 pH 也是不得已而为之。我配培养基时基本上不调 pH ，只是用试纸检测一下 pH ，观察一下培养基的颜色。

（1）东西一定要用自己的。既不要借别人的，也不要借给别人。可能大家觉得比较自私。实际上还是很有好处的。并不是每个人的操作都规范，因此相互之间串着用，很容易造成交叉污染。（ 2 ） 我习惯口对口倒液体，在倒前倒后都要在酒精灯上过一下。自己认为比起用吸管吸更能很好的防止污染。步骤越简单，越能防止污染。而且还能节省很多吸管。

（2）一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要做到半路，又出工作间拿东西，这样增加了污染的机会。

（3）整个操作要快、动作要轻、而且不要干其他的事情。比如手机响了，最好不要接。我一般操作的时候将手机关了，手机声音响起，好烦躁。

（4）我一般开紫外线照射台的时候，就将培养基、酶、 DHANKS 液那到室外让它自然升温。这样 40 分钟后，温度也升上来了。 有很多人将他放到 37 度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生，有的常年不清洗，里面很脏，容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水域锅那出后，最好找个毛巾插干上面的水。

（5）操作前要洗手，用 75% 酒精搽手。用完操作台，要打扫卫生。

细胞要经常冻存，我一般只要细胞状态好就将细胞冻存起来。细胞状态差了，扔掉，重新复苏。这是一个必须养成的习惯。毕竟很多情况下，细胞并不是因为污染了，才让你感到头痛。这样你不会担心没有种子了。我一般是不加双抗的，只要注意，不会污染。

过滤时不要用枪吹细胞 !! 如果用力吹 , 筛网就像刀片一样 , 把你的细胞全部切碎 !!

刷玻璃器皿的过程：初洗、泡酸（一天）、自来水冲洗（ 10 遍）、纯化水冲洗（ 3 遍）、注射用水冲洗（ 3 遍）。感觉过于苛刻，自来水只冲洗 3 遍。被老师发现后，一阵痛批，才知道这是极其关键的一步，残留的酸可能会抑制细胞生长，甚至导致细胞死亡，痛失辛苦得来的细胞，心血付之东流。无知不能无畏，一定不能大意。

做好准备工作。不要急于投身到细胞培养中去，要先设定计划：步骤，工具，试剂。特别是将细胞用于大规模生产时，尤其如此。 eg. 经过干热灭菌的容器一般认为可以在一周内保持无菌状态，如果准备多了，用不完的就得重新灭菌，耗费能源、占用灭菌空间，不值得；干热灭菌需要一天的时间，当器皿准备不足时，只能干着急，错过了最佳操作时间，也许得很久才能将细胞状态再调整好。

对于骄气的细胞，我一般都是第一天处理完后，加少量培基（够盖住瓶底部），第二天换液，以免死细胞和碎片对活的产生不良影响。

新配的培养基直接用很清亮，但是在－ 20 度保存一段时间后再溶解就要出现很多杂质，用 37 度水孵育没有效果，握在手里不停摇动非常有效。其实对于操作熟练的人来说，污染并不是我们想像那样容易出现，论坛里很多人都问否污问题，而培养基的 PH 值往往被忽略，而且大多数人都习惯于一次配制 1 升培养基，分装成 10X100ml ，用 1 瓶，另外 9 瓶放在－ 20 度保存，很容易出现结晶，镜下看就是一些杆状的物资，有时候晃动培养基，肉眼就可以看到很多沉淀，这就需要我们在用之前好好摇匀了。

操作中的安全：a.我犯的一个巨经典的错误至今难忘，刚做时酒精擦手，擦镊子，湿淋淋的就拿镊子过火，结果。。。。火顺着镊子着到手上，虽然不怎么热，可是我手上的汗毛啊， 555 ，都被烧了。这个错误以后再也没犯。 b.过完火的试管口一定不能摸，时刻记着只拿试管的下 1/2 。 c.给酒精灯加酒精永远记住不要拿酒精灯口那个灯心管，否则终身难忘。 d 。当酒精灯出现什么意外时一定要镇静，先让他着一会可能没事，不要慌乱中打坏别的东东。 e 。离心机尤其高转速时，配平当然要牢记，可是一定要检查一下离心机里还有没有其他东东（有一次我离东西，着急，放进去刚离一会我就觉得声音不对，打开一看里面竟然有一根别人没有拿出来的小管子）。还有一次配完平就打开离心机盖准备离心，结果吓个半死，原来别人正在离心，幸好管子没飞出来

细胞冻存： 当细胞状态好，或者代数比较早，一定要大量冻存，不要吝惜暂时的大批使用血清，当细胞状态不好，长不起来的时候，马上取出来复苏，省时省力，不要去尝试努力恢复状态不好的细胞，费时间也费血清，会令你痛苦不堪。另外冻存的细胞不要放到一个地方，－ 80 度，液氮（甚至不同的液氮罐）都放一点，谁也不敢保证不出意外，冰箱也可能有化的时候（我们－ 20 度冰箱就化过），都放在一块容易全军覆没。

按照试剂的保存标准保存，象血清、胰酶等没开封的 -20 ℃ ，开封后 -4 ℃ 保存一般不超过 7 天（用完它吧，不然浪费了）

5、一定要弄清楚每个组分的作用，特点，比如 NaHCO3 容易分解，因此培养基在过滤除菌时 pH 会上升，一般是 0.1-0.3 ，所以在过滤之前，要把培养基的 pH 调低 0.1-0.3 。如果你不了解 NaHCO3 容易分解的特点，就不会做相应的处理，那么培养基不符和要求，细胞就长不好

台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时 , 细胞分离后的存活情况，用 0.4% 台盼蓝直接染色 5-10 分钟，在显微镜下观察即可，活细胞不被染色。方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。