一、  试剂

1、  淋巴细胞分离液：避光4度保存，用前在37度水浴中加温。整个分离过程中，温度应控制在8-28度，温度过高或过低均影响分离质量。

2、  全培养基（用前配置）：RPM1640培养基，内含20%胎牛血清（Gibco）{56℃灭活30分钟}，1.6-1.8% 1M的HEPES，1.2% 0.2mol/L谷氨酰胺，1%青霉素和链霉素。

3、  环胞酶素A（CyA）：5ml(250mg)/瓶，用1640培养基稀释成0.2mg/ml，使用时终浓度为2ug/ml(0.5%)。

4、  EBV液购自中国科学院遗传所，储存于零下80度。使用时从冰箱中取出，37度迅速融化，用0.22um的滤膜过滤，不要超过0.5-1小时。

二、  建株方法

1、  取外周血3-4ml，肝素抗凝（血液室温可放置48小时），应用液浓度5u/ml，可加入5-10ml外周血。

2、  将血液与等量1640培养液混匀后，沿管壁渐渐加入到含有4ml淋巴细胞分离液的离心管中（混合血：淋巴细胞分离液=6：4），3000转离心10分钟。

3、  吸取白细胞层，移入另一支离心管中，加入不含血清的1640培养液6ml，轻轻混匀，进行第一次洗涤。1500转离心15分钟。

4、  弃上清液，再加6ml1640全培养液进行第二次洗涤，离心1500转15分钟。

5、  弃上清液，加入2ml1640全培养基（全培养基加入前，置37度水浴10分钟），然后加入环胞霉素A（4%）和1.2mlEBV液/份，充分混匀后移入到25平方厘米的培养瓶，置37度，5%CO2培养箱中。

6、  每2-3天加入3ml新鲜配制的培养基（1.6% 1M HEPES 缓冲液；15%胎牛血清（FBS）；1%青霉素和链霉素；PRMI 1640补足到100%）。7天左右镜下观察，可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象。

7、  如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液pH值呈酸性，吸出半量培养液，进行等量换液。

8、  当总量达到14ml时转移到75ml培养瓶中，每2-3周加入5-10ml新鲜培养基。

9、  约6-8周，当总量达到45ml时，置50ml离心管中，离心1500转，10分钟。弃上清，加入3ml冻存培养基（5%二甲基亚枫(dimethyl sufoxide)，95%FBS）混匀，成细胞悬浮液。冻存管分装，1ml/管，立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中。

参考文献：

1、  哈尔滨医科大学学报，1997年8月，31卷第4期。

2、  美国斯坦福EBV转染B细胞方法