问：我提取的是贴壁细胞蛋白，过程是

1、PBS洗2遍后，细胞刮刮下后离心（没有消化，这样可以吗？）

2、去上清，每管加入了加了188微升的裂解液和12微升的PMSF（是不是太多了？）

3、离心后，吸取140微升上清到新EP管中。

4、加入5×sds上样缓冲和DTT（这一步的我的比例应该是多少？上清：SDS:DTT=7：2：1）

今天跑胶后，考马斯亮蓝染色发现，条带淡到要靠想像才能看到。请问这样裂解液是不是加多了导致蛋白浓度稀释？我还有一批没有上样变性的蛋白，还有什么补救措施没有，细胞蛋白SDS上样比例是多少？

答：我觉得你做western不够规范。

1、贴壁细胞刮下来或消化下来都可以

2、PMSF一般配成100 mmol/L的储备液（乙醇或异丙醇溶解），然后按1:100稀释到裂解液里，终浓度是1 mmol/L。

3、跑蛋白时，除非你是做表达或看条带有无的，一般都要定量啊，用bcakit或者考马斯定量（后者不是很准，但便宜），至于多少细胞加多少裂解液，一般要靠经验，我主要是看细胞离下来体积的大小决定加多少裂解液的。上样缓冲液有配方的，网上都可以查到。

4、考马斯亮蓝染蛋白是有灵敏度限制的，好像是10 μg吧，在网上能查到，对了，还要排除考染的步骤和配方，论坛里有很多不错的帖子可以借鉴。