amenrenren：为什么筛选了半个月后荧光变得很弱呢?

转染pEGFP-目的基因后36小时候加G418一天就死了百分之78十所以从第二天起就把浓度减半了，又筛了将近十天了，发现留下的基本有荧光，但都比较弱。我分析是G418浓度太低了所致，以至于只要表达甚少就可以生存了。

所以我打算在加大浓度一下大家认为是什么原因呢？

帮我出出注意，荧光太弱到后面会不会就没了，太担心了

生命经纬网友capricornkey认为：

荧光弱，说明GFP表达量少，很可能是由于G418的加入带来了筛选的抗性压力，细胞大量死亡说明转染效率不高；

若LZ使用低抗性进行筛选（1/2），容易出现假阳性，或者未经转染、不含目的片段、没有抗性的细胞在这种低抗性压力下，也适应生存下来，所以荧光值可能很弱，也有可能随后细胞逐渐死亡，荧光逐渐消失。

我认为，开始需要摸索一下G418合适的浓度，也就是要找到致细胞死亡的最低浓度，即将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100μg/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

祝实验顺利！