放射免疫技术又称竞争性饱和分析法。1960年美国化学家R.S.耶洛和S.A.贝尔森提出此法，耶洛因此于1977年获得诺贝尔生理学或医学奖。
　　放射性标记抗原*Ag和未标记抗原（待测物）Ag与不足量的特异性抗体Ab竞争性结合，形成*Ag-Ab或Ag-Ab复合物。因为加入的*Ag和Ab的量是恒定的，当结合反应达到动态平衡后，若Ag量增多，生成的Ag-Ab量增多，*Ag-Ab生成量相对减少，游离的*Ag增多，即Ag与复合物的放射性成反比。反应达到平衡后，用有效的方法将*Ag-Ab和Ag-Ab复合物与游离的*Ag和Ag分离，测量其放射性，即可求得样品中抗原Ag的含量。放射免疫技术是把放射性同位素测定的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，在体外定量测定多种具有免疫活性物质的一项技术。根据放射性元素标记抗原还是标记抗体，把它们分成两大类，一类是标记抗原去检测未知抗原，此为经典的测定方法，称为放射免疫测定法(Radioimmunoassay，RIA)。另一类是标记抗体，去检测相应抗体或抗原，这类标记抗体的方法称为免疫放射测定法（Immunoradiometric assy IRMA）。
　　常用于标记抗原的放射性同位素有 3H、125I、131I等。3H可以置换有机化合物中的氢，不影响原有化学性质，且半衰期长和能量低，便于防护。125I和131I原子的化学性质比较活泼，标记方法简便，多肽、蛋白质与小分子半抗原均可进行碘标记。一些不能直接用碘标记的半抗原，通过接上一个酪氨酸亦可用碘标记之。
　　放射免疫分析法是将检测放射性的高灵敏度与抗体抗原结合反应的惊人的特异性结合在一起的微量分析法，优点是灵敏、特异、简便易行、用样量小，常可测至皮摩尔量。本法的缺点是有时会出现交叉反应、假阳性反应、组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐，有时会影响结果等。
　　放射免疫分析法在内分泌学中用以测定胰岛素、生长激素、甲状旁腺激素、血管紧张素、催化素、黄体化激素、促卵泡成熟激素、前列腺素等，以鉴别、诊断、研究激素的生理和药理作用，以及研究激素和受体结合的机理。在传染病学方面广泛用于乙型肝炎抗原的亚型分类测定。在临床免疫学上测定免疫球蛋白G、免疫球蛋白E及抗脱氧核糖核酸抗体、甲状腺球蛋白抗体、类风湿因子、补体及抗食物抗原抗体。在肿瘤学方面用于测定癌胚抗原、血纤维蛋白溶酶原、叶酸、维生素B12 以及血纤维蛋白原和血纤维蛋白降解产物。在药理学方面可以测定吗啡、氯丙嗪、苯妥英纳、庆大霉素、地高辛、茶碱等，是检测药物中毒和药物代谢的一个比较迅速和简便的方法。
　　为了克服使用放射性标记物所引起的问题，在放射性免疫分析法的基础上，又开发了一些其他非放射性标记的免疫分析方法，主要有酶免疫分析法、化学发光免疫分析法、生物发光免疫分析法和荧光免疫分析法。这些方法分别使用酶、化学发光组分、生物发光组分与荧光基团做免疫标记。放射免疫技术是目前血清学和免疫学中最敏感的一种技术。它能检测到毫微克水平，甚至是微微克水平。它具有专一性强，灵敏度和精确度均高等许多优点。目前放射免疫技术已发展到研究细胞的受体分子，称为放射受体分析技术（Radiorecptor assay，RRA），是采用放射性同位素标记，配基去检测相应的受体分子。这是目前对受体分子进行定量和定位检测最为敏感而可靠的一项技术。另外放射免疫技术在药物的设计、作用机理、生物效应以及疾病的病因探讨诊断和治疗方面均显示出广泛的应用前景。

　　放射免疫法是利用同位素标记的与未标记的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应的方法，研究机体对抗原物质反应的发生、发展和转化规律。美国女免疫学家雅洛，因创立了放射免疫法而荣获１９７７年诺贝尔生理学及医学奖。雅洛１９２１年生于纽约。父母都是犹太人，她从小酷爱自然科学。在大学里，她热衷于物理学。居里夫人自传和核子物理学家美籍意大利人费米的讲演，对她后来的事业产生了很大的影响。她渴望从事科学研究工作。然而，当时的美国，哪个大学也不同意将一笔物理学奖金给一个女人。她主动给一位杰出的化学家当非全日制秘书。由于工作出色，几个月后，伊利诺依大学给了她一份奖学金，并给了她一个助理研究员的位置。从１９４１年到１９４５年，她把主要精力都用在三项活动上：教学、钻研高深课题和准备核物理博士论文。她于１９４５年获得博士学位。从１９４５年起，她边授课，边研究，边著书立说，并在勃隆克斯医院筹备和开发新的放射性同位素应用工作。
　　１９５０年，雅洛专门从事放射同位素的研究。她与她的合作者贝尔森博士合作了２０年，共同创立了放射免疫检验方法。放射免疫法包括两个方面的技术：第一是生物学方面的。它利用特殊抗体的反应，甄别所给定的有机物质；第二是物理学方面的。它将有放射性的原子引入有机物质中，给这些有机物质打上记号。放射免疫法，是一种灵敏度高、较简便的测量法，几乎可测定生物体内任何物质，包括生物体本身分泌的各种激素，病人口服或注射的各种药物，一些病毒抗原等，已广泛用于临床常规检验。
　　放射免疫法是利用同位素标记的与未标记的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应的方法，研究机体对抗原物质反应的发生、发展和转化规律。美国女免疫学家雅洛，因创立了放射免疫法而荣获1977年诺贝尔生理学及医学奖。雅洛1921年生于纽约。父母都是犹太人，她从小酷爱自然科学。在大学里，她热衷于物理学。居里夫人自传和核子物理学家美籍意大利人费米的讲演，对她后来的事业产生了很大的影响。她渴望从事科学研究工作。然而，当时的美国，哪个大学也不同意将一笔物理学奖金给一个女人。她主动给一位杰出的化学家当非全日制秘书。由于工作出色，几个月后，伊利诺依大学给了她一份奖学金，并给了她一个助理研究员的位置。从1941年到1945年，她把主要精力都用在三项活动上：教学、钻研高深课题和准备核物理博士论文。她于1945年获得博士学位。从1945年起，她边授课，边研究，边著书立说，并在勃隆克斯医院筹备和开发新的放射性同位素应用工作。
　　1950年，雅洛专门从事放射同位素的研究。她与她的合作者贝尔森博士合作了20年，共同创立了放射免疫检验方法。放射免疫法包括两个方面的技术：第一是生物学方面的。它利用特殊抗体的反应，甄别所给定的有机物质；第二是物理学方面的。它将有放射性的原子引入有机物质中，给这些有机物质打上记号。放射免疫法，是一种灵敏度高、较简便的测量法，几乎可测定生物体内任何物质，包括生物体本身分泌的各种激素，病人口服或注射的各种药物，一些病毒抗原等，已广泛用于临床常规检验。
　　雅萝（R. Yalow, 1921-）虽然出身核子物理，却致力於医学研究。她工作於纽约市布隆克斯区退伍军人医院，致力于「胜太荷尔蒙的放射免疫分析」，而获得1977年诺贝尔生理医学奖。早在得奖的二十多年，雅萝便在一个偶然的机会里，发现猪胰脏的胰岛素可用来治疗糖尿病，可以使病人产生抗体。这种发现与当时的治疗理论不太合适。因为治疗药物能引起抗体是不可思议的事，因此其发现并不为当时的人所接受。然而，这个发现却引导近代内分泌学的研究进入了新的境界，更由此而推展，使得已往不易测定的身体中的物质得以测定。这个方法就是放射免疫测定法，又叫放射免疫测定法（radioimmunoassav，简称RIA）。
　　脑下腺是大家所熟知的腺体，这个腺体能分泌十种以上的激素，控制生殖、生长。但其分泌各激素的份量并不是一成不变的。以往的测定方法，尤其是实验动物，只能设法测定牺牲动物的一瞬间该动物体中的激素含量，然而并不能了解每小段时间的变化。就像电影的动作一样，已往的测定只能得到一张静止的画面，而放射免疫测定法可以见到整个的动作。原因很简单：因为已往的方法需要大量的血样，甚至整个动物的血，而放射免疫测定法只要1ml的血清，最近更发展到40毫微升的血清（毫微升 ＝ l／l00,000毫升），换句话说放射免疫测定法的灵敏度很高。
　　这称之为放射免疫测定法的方法是怎么一回事呢？先把名字拆开来看一看，放射--免疫--测定法，这里头有两个葫芦，第一是放射，也就是有放射性的东西，第二是免疫，有抗原抗体关系的事情。
　　先讲免疫这个葫芦。大家都打过预防针，打针的目的多半是使身体可以产生一种抗体。至于如何预防离题太远，略去不谈。多数蛋白质的异物叫做抗原，都能使动物产生抗体，而这种抗体十分特化，就是说一种抗原多半只能引起一种抗体，而且多半只能与一种抗体结合。比较容易了解的说法是，一种抗体只「认得」一种抗原。目前的实验证明抗体也「认得」带有放射性的抗原，这就是另外一个葫芦：有放射性的抗原。
　　由上面的叙述，可知放射免疫测定法的方法至少有三件束西；第一、抗体，第二、有放射性的抗原，第三、无放射性的抗原。当这三样东西放在一起，在某一种特定的环境下，抗体便开始与抗原始合，根据质量定律，这种作用会达到平衡。平衡的时候，抗体上结合的有放射性的抗原与没有放射性的抗原的量成反比。换句话说，在一定的体积中，一定量的抗体和一定量的有放射性的抗原，加入无放射性的抗原愈多，结在抗体上的有放射性的抗原愈少。这样，若是能够把结合有抗原的抗体和无结合的抗原分开，然后以测定放射性的方法，测这些抗体的放射性，就可以推算出有多少不具放射性的抗原了。
　　放射免疫测定法将放射性的灵敏度与免疫的特异度融合於一炉，既简便准确又灵敏可靠；刚开始时是为胜太荷尔蒙设计的定量法，现在已推延到一些药物及环境中一些毒素的微量定量。

放射免疫分析的优缺点

　　（一）RIA的优点

　　放射免疫分析具有许多其它分析方法无可比拟的优点。它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质。

　　1．灵敏度高一般化学分析法的检出极限为10-3～10-6g,而RIA通常为10-9（毫微克，ng）、10-12g（微微克,pg），甚至10-15g(毫微微克，fg)、10-18g(微微微克，ag)。

　　2．特异性强由于抗原—抗体免疫反应专一性强，所被测物一定是相应的抗原。良好的特异性抗体，能识别化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体异构体。

　　3．应用范围广据不完全统计，目前至少已有300多种生物活性物质已建立了RIA。它几乎能应用于所有激素的分析（包括多肽类和固醇类激素），还能用于各种蛋白质、肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原以及一些小分子物质（如环型核苷酸等）和药物（如地高辛、毛地黄甙等）的分析，应用范围还在不断扩展。近年来由于小分子半抗原制备抗体的技术有很大的发展，有人预测几乎所有的生物活性物质，只要其含量不低于RIA的探测极限，都可建立适当的RIA法。

　　4．操作简便RIA所需试剂品种不多，可制成配套试剂盒；加样程序简单一次能分析大量标本，标本用量也少；反应时间不长；测量和数据处理易于实现自动化；RIA属体外分析技术，对患者无任何辐射危害。

　　（二）RIA的缺点

　　1．只能以免疫反应测得具有免疫活性的物质，对具有生物活性百失去免疫活性的物质是测不出的。因此RIA结果与生物测定结果可能不一致。

　　2．由于使用了生物试剂，其稳定性受多种因素影响，需要有一整套质量控制措施来确保结果的可靠性。

　　3．灵敏度受方法本身工作原理的限制，对体内某些含量特别低的物质尚不能测定。

　　4．由于放射免疫分析是竞争性的反应，被测物和标准物都不能全部参与反应，测得的值是相对量而非绝对量。

　　5．存在放射线辐射和污染等问题。

　　尽管RIA存在以上缺点，但它毕竟是定量分析方法的先进技术。随着科学技术的进步，放射免疫分析技术将会得到更加广泛、更加深入的发展。

　　二、基本原理

　　放射免疫分析技术，是把放射性同位素测定与抗原、抗体间的免疫化学反应两种方法巧妙地结合起来所形成的一种超微量物质的测定方法。

　　RIA的基本原理，是利用标记抗原（*Ag）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）发生竞争性结合。　在上述反应系统中，当只有*Ag和Ab时，只产生*Ag—Ab复合物，并保持可逆的动态平衡。如反应系统中同时加入Ag,因Ag 与*Ag 免疫活性完全相同，故与Ab具有相同的亲合力。当*Ag为一定量、Ab为有限量、Ag 与* Ag 的量之和超过Ab上的有效结合位点时，*Ag –Ab复合物的生成量与Ag 的量之间呈一定的函数关系。即当Ag 量少时，Ag –Ab生成量多，而*Ag –Ab生成量增多，游离的*Ag 减少。可见*Ag –Ab复合物生成量是受Ag含量制约的。因此，在放射免疫分析中，用已知不同浓度的标准物和一定量的*Ag及限量的Ab反应，采取一定方法将B与F分开，即可算出该标准物在各浓度下*Ag –Ab复合物的结合百分率（B/T）。

　　这一反应过程，可用以下简图说明。图中黑圈表示标记抗原，白圈表示非标记抗原，长条代表抗体，每个抗体有两个结合位点，标记抗原与非标记抗原对抗体有同等的结合能力。

　　当标记抗原与抗体量一定时，结合率（B/B+F）随抗原量增加而降低。在实际工作中，以B/T的值为纵座标，标准物的浓度为横座标，绘成曲线，即竞争性抑制曲线，或称准确曲线。将未知浓度的样品按同样条件操作，所得结合率（%）与标准曲线相比，即可查出样品中待测抗原的浓度。

　　放射免疫分析典型的操作程序如下：首先配制一系列已知浓度的标准溶液，并各取一定体积；于其中加入一定量的标记抗原和特异性抗体；在一定条件下使之反应平衡后，采取适当方法将B与F分离；分别测量其放射性；绘制标准曲线。对样品中抗原的测定，则可在同样条件下操作，在标准曲线上查得含量。

　　由此可见，要成功地进行放射免疫分析，必须解决好以下3个关键性技术问题：

　　（1）标记抗原：要求其纯度高、免疫化学活性好、比放射性强、用量适当。

　　（2）制备抗体：要求其特异性高、选用的稀释度适当。

　　（3）分离B与F：理想的分离方法应当是分离完全、稳定可靠、操作简单、适用范围广。

　　在RIA中，标记抗原质量的优劣，直接影响测定结果，必须制备比放射性强、纯度高的标记抗原，并保持免疫活性不受丧失。同位素有稳定性和放射性两种。放射性同位素可利用其衰变时放出的放射线进行测量，这种测量较灵敏而方便，故多用放射性同位素。标记抗原，常用的放射性同位素有3H、14C、131I和125I等。在使用上各有其优缺点，可根据所进行的放射免疫分析的类型特点，标记物制备和供应情况以及实验室设备条件等作适当的选择。大多数抗原分子中都含有C、H等原子，所以用14C或3H标记不改变抗原的结构及其免疫学活性，且14C、3H半衰期长，所标记的抗原长时间放置后仍可使用，这都是其优点。14C或3H标记的不足之处是操作较繁琐，并难以获得高比放射性的标记物；3H及14C放出的都是弱β射线，需用较昂贵的液体闪烁计数器方能获得较高效率的测量，且测定操作也较麻烦。但某些抗原用放射性碘标记容易丧失免疫化学或生物学活性者，则仍以采用3H或14C标记物为佳。
表  标记抗原常用的放射性同位素及其性质
放射性元素 半衰期 射线种类及能量（百万电子伏特）
  β γ
　　14C 5720年 0.155 －
　　3H 12.5年 0.0189 －
125I 60天 － 0．035
　　131I 8.05天 0.608，0.335，0.250 0.364，0.637，0.722
　　大多数抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改变了抗原的分子结构，往往容易损伤抗原的免疫化学活性；且放射性碘的半衰期较短，标记物放置后因衰变使放射性降低，因而需要经常制备标记物或要求能定期提供放射性碘标记都能适用，放射性碘放出γ—射线，用一般晶体闪烁计数器就能获得较高效率而精确的测量，测量操作也很简单。由于这些突出的优点，目前在放射免疫分析中，使用放射性碘标记物最多。
　　从应用角度来看，131I和125I又各有其优缺点，可根据实验的要求、仪器的条件和放射性碘制剂的规格等条件合理选用。但相对而言，125I有较多的优点，一是半衰期适中，允许标记化合物的商品化及贮存应用一段时间；二是它只发射28keV能量的X射线和35keV能量的γ射线，而无β粒子，因而辐射自分解少，标记化合物有足够的稳定性。放射性碘适用于放射免疫分析许多对象（包括蛋白质、肽类、固醇类、核酸类以及环型核苷酸衍生物等）的标记，且操作简单，一般实验室都不难做到。

　　要制备高比度、高纯度与免疫化学活性好的标记物，首先要有高纯度、良好免疫活性的抗原。用作放射标记加网免疫分析的特异性，所以若用纯度不高的抗原作标记，则标记后必须采取适当的步骤除去杂质，以获得高纯度的标记物。标记对象的纯化应尽量采用温和的方法，否则在纯化操作中已受潜在性损伤的蛋白质（这时表面上活性可能还是良好的），再经标记反应时所受的损伤，活性就会显著降低，影响以后的放射分析结果。有了好的纯抗原，还要采用适当方法加以标记，尽量获取高比放射性、而又能保持良好的特异免疫化学活性的标记物。这些都是放射免疫分析能取得高特异性和高灵敏度的关键问题。
　　多肽激素与蛋白质多用碘标记，最常用的是125I。碘化反应的基本过程如下：通过氧化剂的作用，使碘化物（125I-）氧化成的碘分子（125I2），再与多肽激素、蛋白质分子中的酪氨酸残基发生碘化作用。所以不管采用哪一种放射性碘标记法，标记的化合物内部必须有碘原子可结合的基团，即结构上要含有酪胺基或组织胺残基。凡蛋白质、肽类等抗原，在结构上含有上述基团的可直接用放射性碘进行标记。如不含上述基团的，放射性碘无法标记，必须在这些化合物的结构上连接上述基团后才能进行碘标记。
　　因此影响蛋白质、多肽碘化效率的因素，主要决定于蛋白质、多肽分子中酪氨酸残基的数量及它们在分子结构中暴露的程度；此外，碘化物的用量、反应条件（pH、温度、反应时间等）及所用氧化剂的性质等也有影响。常见的标记方法有氯胺T法、乳过氧化物酶法（LPO）等。 

　　氯胺T法标记效率高、重复性好、试剂便宜易得，是目前使用最多的碘标记方法。
　　1．原理氯氨—T（Chloramine--T）是一种温和的氧化剂，在水溶液中产生次氯酸，可使碘阴离子氧化成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪氨酸苯环上羟基位的一个或两个氢，使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。
　　2．方法以125I—AVP的制备为例。
　　（1）碘化反应：AVP5μg+0.5mol/l PB50μl（pH7.5）+1251800μCi,混合后，加入新配置的Ch—t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振荡混匀，室温下反应40s。
　　（2）终止碘化反应：加入还原剂偏重亚硫酸钠40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5),以终止碘化反应。
　　（3）Bio—Gel P2层析纯化：将碘化反应混合液注入Bio—Gel P2柱，用0.1n HAC溶液洗脱，分部收集，每2min收集一管，共收集60管。
　　（4）放射性测量：测定各收集管的放射性，出现两个峰，第一峰为125I—AVP，第二峰为游离碘盐峰。第一个峰中计算最高的几管，留下备用。
　　为了解标记抗原的质量，每次碘标记后应计算出碘的利用率，标记上多少放射性碘，以及每微克抗原结合上多少放射性碘。
　　（5）标记抗原的贮存：经纯化与检查后的标记物、加入1/8体积的异丙醇，分成若干小份，置于铅罐中，在-20℃以下的冰箱中贮存备用，应避免反复冻融。标记抗原在贮存中是不稳定的，这是因为：一是脱碘，标记的碘从原来位置上脱落，变成游离碘；二是蛋白损伤、变性，成为聚合大分子或断键成小分子碎片。由于上述原因，使B/F明显降低，标准曲线斜率变小，以致不能使用，故需分离纯化，其方法是用Sephadex G100长柱（40～80cm ）过柱，洗脱后出现3个峰。第1个峰分子量大，是蛋白变性的聚合的大分子，尚保留部分抗原决定簇，免疫活性弱；第2个峰是纯抗原的蛋白峰，免疫活性好；第3个峰是游离125I或小分子碎片，不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰，免疫活性好；第3个峰是游离125I或小分子碎片，不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰，其性能类似于新鲜标记的抗原。分离纯化的方法解决了标记抗原的贮存、长期使用问题，特别对来之不易的抗原更显得重要。
　　2．注意事项
　　（1）放射性碘源的选用：无载体的131I或125I均可用于碘化标记，但应尽量选用新鲜的、比放射强度高的、含还原剂量少的放射性碘源。碘源的比放射强度最好≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否则加入碘源的容量要增加，随着带入碘源中含有的还原剂（为放射性碘源运输保存所需加入）量也增加，这将会显著降低碘利用率及标记蛋白比放射强度。放置较久和放射性碘源，一方面因衰变致比放射强度降低，另一方面因水的辐射化学产物增多（主要是131I源），都会降低标记时的碘利用率。放射性碘源含还原剂（如Na2S2O5等）量多时，会抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至导致标记完全失败。放射性碘源要用无载体的，标记所用全部用具和试剂必须不含碘；只要有极少量的碘的污染，非放射性碘就会稀释放射性碘，使放射性碘利用率显著降低。为了便于放射性防护和除污染，以及减少射线对蛋白质分子的损伤，标记投入的放射碘量不宜过大，一般以<5mCi为宜。
　　（2）放射性碘与多肽、蛋白质用量的比例：这比例对标记结果的影响很大。如上述原因，一般标记时放射性投入量不宜过多，示踪实验室中常规每次只用1～2mCi，因而放射性碘与多肽、蛋白质用量的比值主要靠标记时投入的多肽、蛋白质用量来控制。当投入的放射碘量一定时，多肽、蛋白质用量多（即I/多肽、蛋白质比值低），能获得高碘利用率，但所得标记蛋白比放射强度低；相反多肽、蛋白质用量少（即I/多肽、蛋白质比值高），则碘利用率降低，但所得标记多肽、蛋白比放射性随此比值变化都有较大的变动；而当此比值<1后，则碘利用率再下降的幅率较小，标记多肽、蛋白比放射性也不会再增加多少。
　　（3）氯胺T与偏重亚硫酸钠的用量及碘化反应时间：氧化碘化标记法中，会导致失活的最主要原因是氧化还原。氯胺T是氧化剂，早期用氯胺T法作碘化标记时氯胺T用量都比较大，或碘化反应时间较长，结果导致蛋白质结构和活性的严重损伤。氯胺T用量大，或长时间进行碘化反应，结果并不能使碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度提高多少，反而使标记多肽、蛋白活性下降。当用不含还原剂或还原剂很少的放射性碘源时，试以各种蛋白质（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰岛素等）作微量标记，当氯胺T用量为20μg/0.1ml反应液、0～20。C反应20s，碘利用率都已接近或达到最大峰，再加大氯胺T用量和延长反应时间是没有必要的。随放射性碘源中还原剂增多，氯胺T用量也应增加，以达到预期的碘利用率，但决不应盲目加大氯胺T用量和延长碘化反应时间（通常反应时间不要超过1min），否则会导致标记多肽、蛋白质严重失活，不能用于实验。当然，减少氯胺T用量要在了解放射性碘源还原剂含量的基础上，否则碘源中还原剂量较多，双盲目减少氯胺T用量，就会使标记失败。一般用125I标记时，氯胺T用量要适当加大。加入氯胺T后必须迅速混匀，以防标记不均匀。氯胺T与偏重亚硫酸钠溶液要新配制的。
　　氯胺T用量减少了，Na2S2O5用量也就可以随之减少。为保证按时终止碘化反应，实验时加入Na2S2O5一般都是过量的。氯胺T用量大时，加入Na2S2O5的剩余量也就会随之增加，这就可能加重某些对还原剂敏感的蛋白质或多肽生物活性的损伤。为此，Na2S2O5用量也不应过多。只要药品没有变质、试剂是新配的，以重量计算Na2S2O5加入量与氯胺T相同就足以保证终止碘化反应（按反应克分子浓度计算，Na2S2O5/氯胺T重量比约0.4），不要盲目加大用量，并应迅速将标记多肽、蛋白质从反应液中分离出来，以尽量减少多肽、蛋白质活性的损伤。
　　某些蛋白质或多肽对氯胺T较敏感，还可进一步减少氯胺T用量、缩短碘化反应时间、降低反应温度，以保护蛋白质的活性。这对一些较容易丧失活性蛋白质或多肽的碘标记十分重要。
　　（4）碘化反应体积：系指加入Na2S2O5终止反应前液体的总量。碘化反应体积愈小，局部反应物浓度愈高，所得碘利用率和标记多肽、蛋白比放射强度就愈高。所以，标记应采用比放射标记效果。当反应液量少（<0.2～0.3ml）时，反应体积对碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度的高低影响较大；当反应液量大（>0.5～1.0ml）时则影响较小。微量氯胺T法放射碘标记时，一般多控制碘化反应体积<100μl。
　　（5）碘化反应温度：温度升高，碘化反应速度加快，碘利用率有所增加。但总的来看，反应温度的影响不很大，一般从0℃到20℃碘利用率相差不过百分之几，故一般在室温下进行标记操作就可能获得重复性好的结果。有些蛋白质或肽类极易丧失活性，则可在0℃进行碘化反应。
　　（6）碘化反应的pH值：受氧化剂氧化生成的活性碘，对多肽链的酪氨酸基苯环羟基邻位的碘化作用，最适pH是7.3～7.8之间。当pH变化时，碘化位置也会发生变化，例如pH值较高时，组氧酸的咪唑环也可被碘化；当pH4～5时，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羟基吲哚，导致肽链断裂。这些都会影响蛋白质或多肽的放射性碘化反应，或引起降解或失活。因此作放射性碘化标记时，除放射性碘源外，所有的试剂都应用适当的缓冲液配制，保证碘化反应在最佳pH条件下进行。
　　（7）微量蛋白质或多肽的吸附损失：界面的吸附损失，在使用大量蛋白质或多肽类时是可以忽略的，但作微量法标记时投入的蛋白质或多肽类只在微克甚至毫克甚至毫微克水平，界面吸附导致的损失就不能忽略。例如制备131I—ACTH时，所用ACTH浓度低到50Pg/ml时，因表面吸附可损失10%～30%，甚至高达75%。改变pH、加入非特异性载体蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器时，能减少吸附，但不能完全消除。一般残留在反应管和滴管上的放射性为投入总放射性的2%～8%、残留在层析柱上折占5%～10%。残留量随标记蛋白比放射性强度而直线增减，残留者几乎全部都是标记蛋白。由此可见，微量蛋白质或多肽受吸附而损失的量是不容忽略的。由于微量蛋白质、多肽会被显著吸附而丢失，所以标记时投入蛋白质、多肽量过微（如<2μg）也是不适宜的，否则标记蛋白质、多肽的收回率会太低，并在计算上会造成较大的误差。
　　（8）不同蛋白质、多肽碘化标记的差别：由于不同的蛋白质和多肽分子中含有的酪氨酸数目不同，而且其空间结构也不相同，分子中的酪按酸残基有的容易发生碘化反应，有的就不容易碘化，因此同样条件下进行碘化标记，不同蛋白质或多肽对碘的利用率是不相同的。不同蛋白质经碘化标记后生物活性受损的情况也各不相同。例如ACTH、促性腺激素释放激素（GRH）、促黄体激素释放激素（LRH）等多肽，碘化标记后容易丧失激素活性或与受体结合的活性；而AFP及人绒毛膜促性腺激素（HCG）等的碘化标记，则较容易保存良好的免疫化学活性。
　　尽管不同多肽、蛋白度的碘化标记结果有所差别，但上述讨论的因素对不同多肽、蛋白质碘化标记的影响有共同的规律。掌握了这些因素，就容易成功地获得合格的标记物。
　　不同多肽、蛋白质的分子量大小、理化性质各不相同，放射碘化标记反应后，可根据具体情况采取不同的方法将标记蛋白质（或多肽）与未反应的游离放射性碘及受损伤的标记物分开，常用的方法有凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、各种电泳法等。
 

　　本法反应温和，对抗原、抗体免疫活性影响小，已被广泛应用。缺点是标记率较低，一般为20～40%。
　　1．原理此法是利用乳过氧化物酶（Lactoperoxidase）有促进微量过氧化氢对125I-的氧化作用，生成125I+，并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。
　　2．方法以标记蛋白质抗原为例。
　　（1）反应液组成：蛋白质2～5μg溶于磷酸缓冲液10～25μl中，加入Na125i 1m Ci(10μl)、乳过氧化物酶溶液25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl)；
　　（2）在室温保温7min；
　　（3）加入H2O2200ng(10μl)；
　　（4）过7min再加入H2O2(3μl)；
　　（5）保温7min后，加入0.5ml、10mmol/L巯基乙醇以停止反应；
　　（6）10min后加入NaI载体溶液1ml ；
　　（7）按常规方法分离纯化。
　　3．注意事项
　　（1）LPO质量好坏，可直接影响标记率，LPO应在使用前新鲜配制，以防酶活性降低。
　　（2）LPO用量应小于总蛋白质用量的1%，以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。
　　（3）碘化反应速率分析表明，酶的催化速度很快。
　　（4）碘化反应在pH4.0～8.5较宽范围内均可进行，最适pH值应依据蛋白质本身性质而定。
　　（5）H2O2应保持低浓度，如高于0.1mmol/L，对酶的活性将有抑制作用。
 Iodogen碘化法
　　此法具有标记率高、反应体积小（3ml水平）、可用低浓度的125I原料、对多肽激素和蛋白质的免疫活性损失小、稳定等优点，系常规的碘化方法之一。
　　1．原理　用Iodogen为氧化剂，对蛋白质和多肽抗原进行碘化标记，把125I直接引进分子中的酪氨酸残基上。标记过程中被标记样品不与Iodogen混合，标记后取出样品即停止反应，不使用任何还原剂。
　　2．方法
　　（1）标记之前，先把Iodogen溶于有机溶剂，涂于管底，并使之干燥。
　　（2）标记时，将蛋白质溶液10～20μg/10μl(0.5mol/L,pH7.5PB)置于反应管中，反应管置于冰浴中。碘化时，125I与蛋白质克分子之比例为1～1.2。反应时间在温和的连续的搅拌下可达10min，从反应管中转移出反应混合液，使其反应停止。反应液转移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中，层析分离前再放置5min，使其未标记的碘离子还原成分子碘，以避免在带有缓冲液的柱中使白蛋白碘化。
　　3．注意事项
　　（1）涂有Iodogen的反应管，有氮气中密封，并贮存在-20℃条件下，至少可用3个月。打开管，使用时间很短。
　　（2）碘化反应时间，7min时标记率达最高，10min时略有减少。PH6.0～8.5时，标记率最高。
　　（3）Iodogen与蛋白质的比率是标记率的函数。最大的标记率是1克分子的Iodogen与8克分子或再多量之比。
 酰化试剂（Bolton和Hunter试剂）法
　　1．原理这个方法用酰化剂3--（4-羟苯基）丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter试剂）做连接试剂，将125I标记在羟苯基的2，5位置上，再将琥珀酰胺酯水解，通过一个酰氨键将3--（4—羟基—5—125I—苯基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。
　　2．方法125I—Bolton—Hunter试剂可用氯胺T法自行制备，出已有该试剂的苯溶液作为商品出售。使用时取一定量的标记酯（μmol 蛋白用3～5μmol标记酯），用氮气吹除苯，投入欲标记蛋白5～10μg及缓冲液10～50μl,pH8.0～8.5为宜，在冰浴中反应15～30min后，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使过量标记酯消耗掉以终止反应。
　　此法避免了蛋白质与氧化剂的接触，又避免了与放射性碘原子的直接接触，可防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤，适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后会引起蛋白质的失活。其缺点是标记技术比较复杂，需要接触较多的放射性，经二步反应，碘标记率比较低。一般认为此法不宜标记短肽，而适于分子量大于1万的蛋白质。

纯化标记化合物的常用方法
　　不论使用何种制备方法，要获得合格的标记化合物，都必须将反应物经过仔细的分离、纯化。另外，一些标记化合物，经过一定时间的存放后，往往会出现不纯物，而需再纯化。如碘标记生长激素（125--HGH）,在刚标记的第2天，从Sephadex G-100过滤谱上可见，几乎所有的碘化HGH都集中在峰II；保存1个月后，峰II组份减少，峰I和峰III成分明显增加，峰I是集聚的标记生长激素，而峰III是不具有免疫活性的放射性化学杂质。
　　标记化合物的纯化方法，除制备比活度低而化学量又较多的标记物可用重结晶、蒸馏、萃取等常规方法外，一般需用微量分离技术，较方便的是层析法、离子交换法、凝胶过滤及高效液相层析法等。现以碘标记蛋白为例，说明以上各种方法的适用情况。
　　1．凝胶过滤法常用的是Sephadex G系列，也有Biogel—P系列。分离标记蛋白与无机碘时，通常用Sephadex G—25或G—50，然后用G—100进一步纯化。
　　2．离子交换法一般是制成离子交换层析柱，用于分离纯化短肽标记物。
　　3．透析法　能将标记蛋白与小分子化合物很好地分离。
　　4．电泳法可用来分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质。
　　5．亲和层析法利用蛋白质与其特异抗体或受体的结合来分离、纯化标记蛋白质。此法特异性强，保持生物活性好，但操作较复杂。
　　6．高效液相层析法此法最大优点是分离效果好、快速，但需特殊设备。
　　7．伴刀豆球蛋白A（ConA）吸附法ConA是一种植物凝集素，对糖蛋白有良好吸附能力，因此适于分离标记糖蛋白。吸附的标记糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脱。
标记化合物的主要质量指标
　　作为示踪剂及分析试剂的标记化合物，应具有比一般非标记化合物更高的质量要求。标记化合物的质量指标包括：放射性核纯度、放射化学纯度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及标记位置和定量分布情况等。
　　1．放射性核纯度及其检查方法
　　（1）放射性核纯芳可用下式表示：
　　放射性核纯度（%）=所需放射性核素的活度/样品的总放射性活度×100
　　（2）放射性核纯度的检查方法：每一种核素都有它的特征，即物理半衰期及射线能量，故可通过半衰期及射线能量的测定来鉴别所需放射性核的纯度。
　　①测定半衰期法：如短半衰期放射性核素，一般可采用时间跟踪法，每隔一定时间测量放射性一次，共测3～5个半衰期，以每次测得的放射性计数为纵座标，时间为横座标，在半对数纸上作图，并通过分析，可求出该放射性核素的纯度。
　　②测定射线能量法：利用每一放射性核素的特征射线谱来检查放射性核纯度。γ发射体可用γ能谱仪，如检测57Co和58Co的核纯度：纯β-发射体可用液闪仪，调节　道宽及淬火校正后，对如3H、14C、32P的核纯度进行测量；而β、γ混杂垓素，则用吸收法测量，如99mrTc中母体杂质99mMo的含量测量，是通过适当厚度的铅屏蔽，将99mTc 发射的能量为141ke V的γ射线减弱后，测定99Mo发射的能量为739Kev 的γ射线。
　　2．放射化学纯度及放化纯度鉴定
　　（1）放射化学纯度：放射性核素标记化合物都是以一定的化学形态存在的，所以：
　　放射化学纯度（%）特定化学形态的放射性活度/样品总放射性活度×100
　　放射化学纯度受制备方法及原料的化学纯度、产物存放条件等影响，一般放化纯度控制在95%以上。
　　（2）放射化学纯度的测定方法：原则是高效的化学分离与灵敏的放射性测量相结合。常用下列方法：
　　①放射层析法，又称放射色谱法：本法是利用色谱技术使混合物中各组份分离，然后测定各组份的放射性活度。它具有选择性高、分离效果好、操作简便等优点，在放化纯度鉴定中是一种重要的分析方法。最常用的是放射性纸层析法和放射性薄层层析法。
　　②放射性高效液相层析法：它对分离纯化标记化合物及鉴定标记化合物的放化纯度都有很大潜力，具有分析速度快、分离效率高、适用范围广等特点（几乎80%的有机化合物均可应用）。关键是要选择合适的固定相和流动相，使产品与杂质分离。在流动相中，被分析物各组份的浓度变化可用紫外或荧光检测器检测，而其放射性活度，可同时由放射性探测仪测定。放射性活度测定最简单的一种办法，是将洗脱液分部收集，然后在γ仪或液闪仪上进行测量；另一种较理想的是连续测量，在洗脱液流通池外包围一个固体闪烁探头，进行γ计数或在流通池前加一个三通混合室，用另一个泵混入闪烁液，测定软β射线。可以与紫外控测器的扫描图，同步描绘出放射性的分布图。
　　③放射性核素反稀释法：取一定量（W1）已测定比活度（SO）的标记化合物（约0.1～10mg），用>1000倍化学量（W2）的纯载体稀释，充分混匀后反复纯化到比活度恒定不变（Sp）.
　　有时该值>100%时，往往是由于所用载体化学纯度不够。因本法操作要求严格，一般不作常规放化纯度鉴定用。
　　3．化学纯度及化学量的测定标记化合物中的非放射性化学杂质虽一般不会对示踪结果带来直接干扰，然而这种杂质的含量越多对标记化合物在使用、存放过程中分解、变性的影响就越大。此外，也已发现某些标记化合物的化学杂质会给使用带来直接影响。如用氚标记类固醇作放射免疫分析试剂，其中的化学杂质会影响标记抗原与抗体的结合率，使分析灵敏度降低。因此，对标记化合物的化学杂质含量，同样必须加以控制。
　　要制得化学纯度的标记化合物，最好是对可能产生的杂质加以防止。这要在冷试验中解决。因为冷试验所得产品是非放射性的，其化学纯度可用常规方法，如溶点、沸点测定，NMR、红外、紫外谱分析等手段加以鉴定，得到合格产品后，再按同样方法及条件进行标记制备。
　　对于标记化合物的化学含量，则必需在标记反应及一定纯化步骤后进行，由于需要高比活度的标记化合物，往往样品的放射性很强，而化学量极微（如某氘标记化合物，分子量为300，每分子上标记2个氘原子，氘的同位素活度为99.8%，则理论上每25mCi（925MBq）的化学量还不足（130μg）,所以需用微量分析法才能测定其含量。一般而言，各种常规微量分析技术均可应用。目前大多用紫外分光、荧光光度等进行含量测定。
　　4．放射性比活度及其测定
　　（1）放射性比活度简称比活度，过去也称比放射性。
　　比活度＝放射性活度／单位化学量
　　（2）比活度的理论值计算：每种放射性核素有一个比活度理论值，取决于该核素的半衰期和衰变常数。

　　放射免疫分析时加入的抗原和抗体的量极微，反应所形成的复合物并不能成为肉眼所能辨认的不溶性沉淀物，但是放射免疫分析必须分别测量与抗体结合的（B）和游离的（F）抗原，所以，B、F的分离是放射免疫分析中的一个重要环节　。根据抗原—抗体复合物与游离抗原理化性质或免疫学性质的不同，可采取各种分离技术。

　　一、对分离方法的要求

　　分离方法的选择直接影响分析的质量，通常需满足以下要求：

　　①使B和F分离完全；②不受外界因素的干扰而影响分离效果；③与游离抗原的非特异性作用尽可能小；④操作简便，分离迅速，重复性好，适用于大量样品分析；⑤来源广，价格低廉，便于使用，适合RIA技术自动化。

　　二、常用的分离方法

　　目前用于放射免疫测定中的分离方法很多，各有其优缺点，下面介绍几种常见的分离方法：

　　（1）吸附分离（固相颗粒）

　　活性碳吸附剂（目前常用）

　　硅镁吸附剂（滑石粉等）

　　交换树脂吸附剂

　　（2）蛋白沉淀剂

　　硫酸铵、硫酸钠

　　聚乙二醇（PEG）（目前常用）

　　无水乙醇、丙醇等

　　（3）免疫分离剂（第二抗体）

　　（4）磁性分离剂

　　磁化活性碳吸附剂

　　磁化固相抗体

　　（5）固相包被分离法（固相分离剂包被在测试管内）

　　（一）吸附分离法

　　这种吸附分离剂是固相颗粒，它可以从反应液中吸附游离抗原。

　　活性炭是常用的吸附剂。活性炭多用于小分子游离抗原和抗原—抗体复合物的分离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合物。这样活性炭末的表面构成一定大小的孔洞，在反应液中加入这种特殊颗粒的混悬液时，小分子的游离抗原被活性炭吸附，达到分离B与F的目的。

　　活性炭吸附方法的优点是操作简便、价廉，缺点是离心沉淀部分是F而不是B，不适用目前自动化放免测定，分离时易受温度和时间的影响。

　　（二）沉淀分离法

　　沉淀分离法的原理，是盐类或有机溶剂能够破坏蛋白质分子表面的水化层而发生沉淀（这种分离要求蛋白质分子处在等电点环境中）。常用的沉淀剂是聚乙二醇（PEG）。PEG是一种直链大分子聚合物，使用PEG溶液时分离沉淀是在有载体血清蛋白或丙种蛋白存在，而且要求γ球蛋白的最终浓度达250mg/ml以上的情况下才能实现。PEG沉淀的结果易受过量的脂类或离心温度的变化影响，PEG离心温度在20℃以下进行。PEG沉淀的优点是PEG价格低廉，操作简便，一次可处理大量样品。其缺点是PEG单独使用时非特异结合高，所以常与其它方法联合使用；其分离效果易受pH、温度等影响。

　　（三）双抗体分离法

　　双抗体分离法也称免疫分离法，是特异性分离，应用十分普遍。本法是以抗IgG抗体和可溶性的抗原-抗体复合物结合，形成很大的复合物而沉淀。很多抗原的特异抗体来自家兔或豚鼠，称为第一抗体，形成的复合物不能通过离心将其沉淀。或将第一抗体的同种正常动物的血清IgG免疫另一种动物所制得的抗体为第二抗体，该抗体与第一抗体形成不可溶的复合物，经离心可将其沉淀，从而达到分离的目的。

　　第二抗体分离的优点是重复性好，B和F分离较为完全，非特异结合低，可同时处理大量样品，使用方便。缺点是分离时间长，非特异性结合可有较大的波动，第二抗体用量较大。

　　（四）磁性分离法

　　1975年，Hersh报道了用磁化分离技术分离血清狄高辛放免测定的B、F后，受到了广泛的重视。近年来国内外许多学者对磁化颗粒的制备进行了系统地研究，应用于B与F的分离，并取得了引人注目的进展，使放免的B、F分离不再使用离心，缩短了放免操作时间，便于放免自动化测量。磁性分离的具体原理为血清样品与标准品中的抗原与磁颗粒上的一定量的抗体反应，产生的抗原抗体磁性颗粒复合物，在磁场作用下沉降，使结合部分与游离部分分离。在磁性分离器上弃上清，进行测量。优点是简化了操作程序，B、F分离也较完全，稳定性好。

　　目前常用的磁性分离技术除磁性固相抗体外，还有磁化活性炭吸附分离剂。

　　（五）固相包被分离法

　　近年来由于固相技术的研究使其固相所被（埋）技术发展迅速，再有固相包被具有简便、快速、稳定、不需离心等优点，有逐渐取代液相法的趋势。

　　1990年，Causse报告了活化塑料管新技术及生物素结合抗体、亲和素标记物的应用，使放免技术对多数微量物质的检测可达到10-15g级水平，大大提高了放免测定的精确度、灵敏度。

　　抗体包被：物理吸附法—方法简便，但包被量低。

　　价键结合法—需要纤维素、琼脂等固相载体，操作复杂。

　　Causse活化塑料管新技术，提高了包被量，主要特点是将顺丁烯二酸酐和苯乙烯的共聚体涂布试管，在试管壁形成一层活性薄膜（这种方法操作简便）。

　　（六）双抗体+PEG的分离法

　　这种分离方法利用双抗体特异性强、PEG沉淀简便快速的优点，从而克服了双抗体时间长、PEG方法非特异结合高的缺点。这一方面是当前分离技术中较理想的一种方法。

　　这种联合方法分离方法减少了第二抗体的用量，PEG的最终浓度也只需2～4%，成本较低。这种方法既适用于蛋白质、酶、大分子物质，又适用于小分子肽等半抗原物质。

　　样品的正确收集与处理，是蛋白质及多肽激素放射免疫分析取得成功的前提。不同的样品与测定项目，其前处理有不同的要求。下面以神经肽测定为例，介绍样品的前处理方法。

　　一、脑、脊髓与垂体中神经肽的提取（以大鼠为例）

　　1．大鼠称重后，在尽量安静的情况下，迅速断头、取躯干血。

　　2．尽快取下全脑、脊髓（某段）与垂体，在沸生理盐水中煮5min，以灭活酶，保持神经肽的稳定。

　　3．根据实验要求分出脑区（如小脑、桥延脑、下丘脑、中脑或中央灰质、丘脑、皮层、海马、纹状体等与垂体前叶。

　　4．脑区等称重。

　　5．把脑区、垂体或脊髓，分别置于玻璃匀浆管内，加入1mol/l HAC（或HCl）1ml，充分匀浆后倒入塑料指形管中，在室温下放置100min，使生物活性物质充分溶解在酸中。

　　6．加入1mol/l NaOH 1 ml，中和酸。

　　7．离心，取上清。

　　8．低温（-20℃以下）保存待测。

　　二、大鼠脑神经核团微穿孔取样方法（以下丘脑为例）

　　1．大鼠迅速断头，取出全脑，置沸生理盐水中煮5min。

　　2．将全脑置于取材角度器上，分别于视交叉前和乳头体后用双面刀片垂直切断，取下丘脑块。

　　3．将双面刀片装在切片机上。

　　4．将下丘脑置于切片机机载物台上，腹侧向下，并用502胶水固定。在脑块后方适当放置琼脂块以利固定。

　　5．开动振动切片机，缓慢移动推进器，切片厚400～500μm。用毛笔沾生理盐水，小心收集切片置于平皿内的生理盐水中。

　　6．将脑切片平置于橡皮板上，并在体视显微镜下，参照鼠脑立体定位图谱，确定神经核团位置。

　　7．选择相应直径的穿孔器，分别于两侧核团上垂直插下，然后推出针蕊将所取核团组织放入匀浆器中。

　　8．加入1mol/l HAC 0.5ml, 充分匀浆后倒入放免测定管中，放置100min。

　　9．加入1mol/l NaOH 0.5ml中和酸，离心（3000rpm/min）20min，取上清液，低温保存待测。

　　三、内脏、肿瘤组织中神经肽的提取（以胃粘膜为例）

　　（1）取下胃粘膜后，迅速称重置于试管，中沸蒸馏水1ml，在水浴中煮100min。标本在室温下放置，其中的生物活性物质会被酶降解，所以要立即加热处理。

　　（2）冷却后倒入特殊的匀浆器中，充分匀浆（使用电动搅拌器）。匀浆液倒入塑料指形管中，再用蒸馏水1ml，冲洗匀浆器，并倒入上述管中。

　　（3）离心，取上清，低温保存待测。

　　四、血浆

　　1．直接测定

　　（1）加酶抑制剂：准确采全血若干毫升，注入预冷的加有①抗凝剂0.3mol/l EDTA·2Na（乙二胺四乙酸二钠）溶液（每毫升全血20μl）、或1%肝素（每毫升全血10μl）；②抑肽酶（每毫升全血500单位）的塑料指形管中，迅速低温离心，取血浆低温保存待测。

　　抑肽酶有液体的（标签写的有每毫升含多少单位）与固体的（每毫升含12TIU，1TIU=900KIU，即每毫克含10800单位）。固体的抑肽酶可用生理盐水溶解，使之每20μl含500单位。

　　（2）酸化处理：每毫升血浆加1mol/l HCl 0.2ml，低温保存待测。测定前加1mol/l NaOH 0.2ml。

　　以上两种方法，任选一种即可。

　　2．间接测定血标本经提取后，可去除蛋白质等干扰因素，并使微量的生物活性肽浓缩，但较费时，成本也高。常用的提取方法有：

　　（1）柱层析提取法：有多种层析柱可供提取不同的神经肽，其中较为方便的是用Sep-pak C18层析柱提取。主要步骤步：

　　①柱的预处理：该柱有两头，长头连接注射器，可注入溶液与样品，短头为排出口。预处理时注入乙腈10ml。蒸馏水20ml，使柱中的生物胶活化。

　　②注入样品（如血浆、脑脊液、腹水、尿等）：样品中的水份流出，生物活性肽、蛋白及杂质等吸附在生物胶上。血浆上柱前，如先去除蛋白，可增加柱子的使用时间。]

　　③淋洗：用4%HAC溶液100ml注入柱中，以洗去一些杂质。

　　④洗脱：用7ml酸性乙腈（按容积算，每100ml中含有乙腈75ml、HAC4ml、蒸馏水21ml）作为洗脱剂，注入柱中，把生物活性肽洗脱下来，收集在塑料指形管中。

　　⑤清洗：用乙腈、蒸馏水清洗柱子，以备后用。

　　⑥将洗脱液吹干，低温保存待测。测定时可加入一定量的缓冲液溶解。

　　Sep-Pak C18柱层析，也可用于制备标记抗原时的层析纯化。

　　（2）加膜藻土提取法：

　　①抽血：用一次性塑料注射器抽取受试者静脉血4ml，置于加有肝素（125单位/ml 全血）指形管中。

　　②分离血浆：在4℃下离心，取出血浆。

　　③血浆酸化：取2ml血浆，加入1mol/l HCl 0.5ml, 摇匀。

　　④吸附：加入0.5%藻土悬液2ml，在水平震荡器上震30min。离心，去上清，留沉淀。

　　0．5%藻土县液（Fuller’s earth)的配制：

　　0.5g Fuller’s earth

　　0.1g Dextran T70

　　100ml去离子水

　　⑤洗脱：在沉淀管中加入80%酸性丙酮1ml，在漩涡振荡器上振2min，离心，取上清置于经硅化的玻管中。

　　80%酸性丙酮的配制：

　　80ml丙酮

　　20ml 1mol/L HCl

　　⑥去脂：加入石油醚1ml，摇匀，脂肪溶解在石油醚中，分层后吸去上层。

　　⑦干燥：下层液体，置于37℃水浴中，用氮气（或空气）吹干。

　　⑧低温保存待测。测定时用一定量缓冲液溶解。

　　（3）有机溶剂提取法：常用的有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等。将溶剂按一定比例，加入标本内，混匀、振荡、离心，取上清吹干，冷藏待测。通常在有机溶剂中加入适量的酸。

　　在这些方法中，以柱层析法最稳定、准确，但成本高，推广不易。加膜藻土法，提取率较高，但操作复杂、费时。有机溶剂提取法操作方便，成本也低，虽稳定性较差。

　　五、脑脊液

　　1．煮沸收集脑脊液时，管子浸在冰水中。收集完毕，立即在沸的水浴中煮5min。离心、取上清；低温保存，待测。

　　2．酸化在1ml脑脊液中加入1mol/l HCl 0.2ml；测定时，再加入1mol/l NaOH 0.2ml中和。

　　3．加酶抑制剂

　　4．柱层析提取

　　以上方法，任选一种。

　　六、尿

　　尿液收集于事先加有适量醋酸或盐酸的容器中，使pH达4左右，煮沸1～2min，冷却后离心，取上清，加适量NaOH液，使尿液pH达7.0左右。此尿即可用于直接测定或经提取后再测定。

　　尿认提取法相同。采用Sep—Pak C18柱层析提取较为方便，因尿中不含蛋白，柱子可多次使用。

　　七、胃液

　　抽取胃液，注入加有抑肽酶的管中，离心，取上清，低温保存待测。

　　一、放射免疫分析的基本试剂

　　（一）标准品

　　标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被涮物质的量，故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。标准品作为定量的基准。应要求高度纯化。标准品除含量应具有准确性外，还应具备稳定性，即在合理的贮存条件下保持原来的特性。

　　按实验要求，将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液，用于制作标准曲线。

　　（二）标记物

　　标记抗原应具备：①比放射性高，以保证方法的灵敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；④标记简便、易防护。

　　要准确测量B与F的放射性，必须有足够的放射性强度。所选用的标记抗原的量，在使用125I时达5000～15000cpm。

　　（三）抗体

　　应选择特异性高、亲和力强及滴度好的抗体，用于放射免疫测定。

　　根据稀释曲线，选择适当的稀释度，一般以结合率为50%作为抗血清的稀释度。

　　（四）B与F分离剂

　　以2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭溶液的配制：

　　活性炭2g（杭州木材厂生产，森工牌732型）

　　右旋糖酐T200.2g

　　加0.1mol/L PB 至100ml

　　电磁搅拌1h，然后置于变通冰箱冰箱待用。

　　（五）缓冲液

　　放射免疫分析技术所用的缓冲液有多种，要通过实验选用抗体和抗原结合最高的缓冲液。

　　目前最常用的缓冲液有下列几种：①磷酸盐缓冲液；②醋酸盐缓冲液；③巴比妥缓冲液；④Tris –HCl缓冲液；⑤硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。

　　在缓冲液中，除必须有弱酸及弱酸的盐成分外，还应根据不同检测项目加入下列物质：①保护蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明胶，浓度为0.1%～0.2%，用以降低试管对抗原的非特异性吸附。②防腐剂：多采用0.1%叠氮钠、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制剂：如测定心钠素等肽类激素时，要加入适量的抑肽酶，用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解；又如测定cAMP、cGMP时，需加入EDTA·2Na，抑制磷酸二酯酶的活性。④阻断剂：在测定甲状腺激素或测定某些甾体激素时，必须加阻断剂，使和蛋白质相结合的激素，变为游离型。常用的阻断剂有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水杨酸钠、三氯醋酸钠等。⑤载体蛋白：采用二抗作B与F分离剂时，要向反应液中加入适量与第一抗体同种动物的正常血清。在测定不含有血浆蛋白的样品时，用PEG沉淀剂分离B、F，必须加适量γ球蛋白或正常人混合血清。

　　在神经肽的RIA时，常用PELH缓冲液，（按1000ml,pH7.6）：

　　0．1mol/l PB　　　　　　　　980.0ml

　　0.3mol/L EDTA·2Na　　　　　10.0ml

　　0.2%洗必泰溶液　　　　　　　10.0ml

　　溶菌酶　　　　　　　　　　　1.0g

　　二、加样程序

　　由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同，而出现两种加样程序，分述如下：

　　（一）平衡饱和加样程序

　　1．基本原理所谓平衡饱和，是指抗原和抗体反应达到再不结合，也不解离的平衡状态，称为饱和状态，即平衡饱和。所以，有人称此为饱和分析法。这意味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。

　　2．加样程序一般先加标准物或被测样品，再加抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。

　　在小分子半抗原的放射免疫分析中，标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲合力常常是不相同的，前者比后者的亲合力高。因此，上述加样程序就更有必要，所以一般都采用先加标准物或样品和抗血清，后加标记物。这样测定也比较稳定。

　　在大分子蛋白质抗原的放射免疫分析中，如果是双抗体分离法，抗原和标记抗原与抗体三者加样，可不分先后，有的是标准物、标记物、抗血清的加样顺序，但一般习惯还是标准物或血样、抗血清、标记物、然后混匀温育24～48h，再加双抗体，继续温育24h，使免疫反应达到平衡。对一些多肽激素的放射免疫分析，应用双抗体分离法，其流程比较长，这样的顺序同样可不分先后。

　　以大鼠垂体、下丘脑β-内啡肽RIA测定程序为例：

　　（1）加样（单位μl；总反应体积500μl）

　 标准曲线 样品 　 T NSB Bo 5Pg 10Pg 50Pg 100Pg 500Pg 1ng 垂体 下丘脑 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 β-EP标准液 / / / 100 100 100 100 100 100 / / 样品 / / / / / / / / / 1 100 β-EP抗血清 / / 100 100 100 100 100 100 100 100 100
　　125-β-EP溶液 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 缓冲液 / 400 300 200 200 200 200 200 200 299 200

　　（2）孵育：4℃，24h

　　（3）分离B与F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，摇匀，立即离心，去上清，测沉淀（F）的CPM数。

　　（二）顺序饱和加样程序

　　1．基本原理先将标准物或血样品与抗血清混匀，免疫反应6～24h，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，然后再加入标记抗原，与抗体反应12～24h，最后分离B与F，这称为顺序饱和分析法。

　　应用顺序饱和加样，可以提高测定方法的灵敏度。Utiger在做人促甲状腺激素（TSH）放射免疫分析时，将标记物延至第2天加入，发现其灵敏度增加两倍。如果缩短最后的温育时间，仍可取得满意的结果。所以一般认为，在顺序饱和加样中，第1次温育时间可以长，而第2次温育时间要短，这样可以提高灵敏度。但也有相反的意见，认为顺序饱和加样，是使用过量抗体，会使灵敏度受到一定影响。如果使用抗体不过量，温育时间缩短，在抗原和抗体结合未达到平衡饱和时就加入标记物，这样既不影响加灵敏度，反而比较稳定，甚至可提高灵敏度。

　　2．加样程序　以人血浆精氨酸加压素RIA测定程序为例（直接测定）。

　　（1）加样（单位μl；总反应体积600μl）

　 标准曲线 血浆 T NSB Bo 1Pg 5Pg 10Pg 50Pg 100Pg 500Pg 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AVP标准液 / / / 100 100 100 100 100 100 / 样品 / / / / / / / / / 300 无肽血浆 / 300 300 300 300 300 300 300 300 / AVP抗血清 / / 100 100 100 100 100 100 100 100 缓冲液 / 200 100 / / / / / / 100 在4。C下孵育12～24h
　　125I-AVP 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

　　（2）孵育：4℃，24h。

　　（3）分离B与F。

　　无肽血浆，用于血浆的直接测定。其制备方法为：在电磁搅拌下，抽取2%加膜活性炭溶液5ml，共两管，离心、去上清。血浆5ml，倒入上述活性炭管中，加盖，充分振荡10min，离心，上清倒入上述另一活性炭管中，振荡10min，再离心，取上清，即无肽血浆。血浆中的生物活性物质被活性炭吸附而去除。

　　（三）计数、绘制标准曲线与测定样品含量

　　以活性炭分离B与F，沉淀计数是F的cpm。T—F—NSB，得B的cpm数。

　　计算标准管与样品管结合（B）的cpm数及与零标准管结合（B0）的比（B/B0×100%）。

　　用半对数纸，以标准管的B/B0为纵座标，以各标准管含量为横座标，绘制标准曲线。

　　根据样品的结合率（B/B0×100%），从标准曲线中找出被测样品抗原的含量，再换算成每毫升血浆含某抗原的量，或每毫克（组织湿重）含某抗原的量。

　　三、放射免疫分析的质量控制

　　（一）质量控制的目的和内容

　　放射免疫分析的质量控制实际上就是控制测定误差，监督测定结果。它包括两方面的内容：一方面对测定结果做精确分析；另一方面鉴定常规测定方法，对那些测定结果不好的方法加以改进，并建立新的测定方法。质量控制分四个方面：

　　1．在一个测定方法内产生的误差。

　　2．在同一实验室内不同方法之间产生的误差。

　　这两种情况属于内部质量控制。

　　3．用同一测定方法，在各实验室之间产生的误差。

　　4．采用不同方法，在各实验室之间产生的误差。

　　后两种情况属于外部质量控制。

　　（二）放射免疫分析中造成测量误差的因素

　　误差包括系统误差和随机误差。系统误差发生在测量过程中由于仪器不准、试剂不纯、标准品不稳定等原因，使测定结果呈倾向性偏大或偏小，这种误差应力求避免。随机误差是测量过程中各种偶然因素造成的，没有固定的倾向性，这类误差是不可避免的，必要时做统计学处理。

　　造成误差的可能来源有以下几个方面：

　　1．各种仪器：设备的准确性、稳定性、效率以及被污染等情况带来的误差。如：①由于放射性测量仪器的稳定性、效率、样品试管的材料和均匀性及被测物的放射性强度等原因。②由于样品的自吸收，本底校正，测定时间，可能的污染等原因。③在试验室中所有的移液管、微量取样器以及天平的刻度、校准和使用方法等原因。④由于反应试管、移液管以及测定用试管等表面清洁度和所引起的不同吸附等原因都可以对测定结果带来误差。

　　2．试剂的纯度、质量和稳定性的影响也是造成误差的重要因素。如标记抗原的比度、纯度，辐射自分解，抗体的稳定性，分离剂、阻断剂及缓冲液等试剂的纯度等。

　　3．在放射免疫分析中一些基本操作，如取样、提取、沉淀、分离以及保温条件不适当等造成的误差。由于工作人员熟练程度不同也常常带来误差，如操作移液管垂直程度、下流速度、吹气与不吹气等。工作人员草率、不按规程操作等也都可以造成误差。

　　4．样品误差。样品的收集方法、贮存温度、放置条件，微量样品取样的准确度，样品可能造成的污染以及样品的变性（如免疫反应活性的降低、蛋白质的变性等）也都能造成测量的误差。

　　5．提取及层析分离过程中的丢失。

　　（三）放射免疫分析中测量误差的控制

　　1．选择准确性高的方法：对各种方法进行比较，淘汰粗糙及难以重复的方法。

　　2．建立方法对比。用相同的测量方法和不同的测量方法在同一实验室和不同实验室，在同一地区和不同地区，在同一时间和不同时间，对同一样品进行对比，检查产生误差的原因。

　　3．建立各种类型的标准。对标准品应规定纯度及制备方法，使用年限及贮存条件。

　　4．建立操作规程，按章　操作。对使用的试剂、仪器设备要经常检查其有效性，更换试剂时应进行必要的鉴定，必要时对测定方法要做重复性试验和回收试验。

　　5．建立可靠的检查制度。经常对测定结果进行核查，利用控制血清、标准血清检查每批结果的准确性。

（一）原理
当抗原遇到相应的抗体便形成抗原抗体复合物（Ag＋Ab ↔Ag －Ab），当用放射性同位素标记抗原再与相应的抗体结合便形成标记抗原和抗体复合物。即： Ag+Ab↔ Ag－Ab。当标记抗原和未标记抗原一起加入相应的抗体时则两种抗原产生相互的竞争，而生成有标记抗原和抗体复合物以及非标记抗原和抗体复合物。生成标记抗原抗体复合物与非标记抗原的含量在一定的限度内是呈反比的，所以利用这个原理去测定未知抗原或抗体。
如果Ag多则*Ag－Ab（即结合抗原B）生成量减少，*Ag（即游离抗原F）的剩余量就多。相反，Ag少，则*Ag－Ab生成量就多，*Ag的剩余量就少。通过检测游离抗原F和结合抗原B，就可知未知抗原的存在与否以及含量的多少。
（二）放射免疫抗原的制备
1、完全抗原  为了保证免疫反应的特异性，对放射免疫抗原要求的纯度较高，必须在90%以上。通常采用电泳、凝胶过滤、离子交换层析等技术获得较高纯度的抗原。纯化的抗原必须经过纯度鉴定才能使用。鉴定办法：通过电泳只出现一条沉淀线，或者以圆盘电泳进行纯度分析。
2、半抗原  要获得较好的免疫原性，必须将半抗原与蛋白质大分子的载体结合起来形成一个完全抗原。结合的载体，通常包括血清白蛋白、 球蛋白、纤维蛋白、甲状腺球蛋白、鸡卵蛋白等。连接方式则因半抗原的功能基团与蛋白质载体功能基团所决定。常用的连接剂有二亚胺、二异氰酸、过碘酸盐等。
（三）抗体的制备与提纯 
（四）抗原的标记
1．放射性同位素的选择  选择同位素的原则。
⑴ 定方法简单、经济、便于推广应用。
⑵ 易于防护。
⑶ 同位素与标记物结合好，不易从标记物上脱落。
⑷ 对标记物不引起辐射损伤，使蛋白变性。
⑸ 具有较高的计数效率。
目前常用的同位素有3H、125 I，其它还有14C、35S和32P等。① 3H  因所有的有机化合物中均含有氢，用3H来置换氢，不至于影响其原有化合物的化学性质。3H的半衰期长，是一个弱 衰变，能量低，便于防护。一次标记可以使用较长时间，采用闪烁仪测量，测量效力可达60%。3H标记要求条件较高，一般需由专门机构来承担，不易推广；② 125I 碘标记的化合物比度高，标记方法简便，而且标记物可在碘化钠晶体﹟型计数器上直接测定。125I发射 射线，含有酪氨酸的蛋白质和多肽均可用放射性I标记。目前，连接标记技术已有相当发展，致使许多非蛋白质和多肽的半抗原也可以用碘来标记。另外碘的放射能量较大，半衰期也较短。
虽然125I的放射比活性仅为131I的13%，但125I的半衰期较131I长，同位素丰度大，辐射损伤小，计数效率也较高，因此125I比131I更为常用。
2．标记方法  目前常用的是碘标记法。碘化标记的方法很多，如氯化碘法、乳过氧化酶法、过氯酸法和连接标记法等。但比较起来，氯胺T法最为简便，效果好，易于采用。
氯胺T碘化标记法的原理：氯胺T是一种氧化剂，在水溶液中可以缓慢地释放次氯酸，因而可以在标记的过程中形成一种能产生温和氧化效果的中间体，它可使放射性碘离子氧化而呈活泼形式的碘离子，并取代抗原分子中酪氨酸苯环羟基邻位的一个或二个氢原子，使之成为含有碘化酪氨酸的多肽链。其记过程为：
⑴ 将蛋白质抗原以0.5Mol/L pH7.5PB液稀释为20μg/μl，取5μl~10μl。
⑵ 取Na125I 5μl(含2mci~3mci)。
⑶ 将1mg氯胺T溶于0.5Mol/L pH7.5PB液 0.1ml中。
⑷ 再将Na125I和氯胺T分别缓缓加入蛋白质液中，于冰浴中边加边搅拌，加完后再搅拌5min。
⑸ 加0.1ml(含3mg)偏重硫酸钠(以PB液配制)。
⑹ 再加1%碘化钾液1滴，看液体是否完全透明。如仍呈棕色，应继续加少许的偏重硫酸钠。
⑺ 过SephadexG50柱，取第一峰，即为碘标记的蛋白质抗原。
3．标记的最佳条件
⑴ 放射性碘比活性要高。
⑵ 反应体积要小。
⑶ 标记反应的pH值，以pH7.5为宜，超过8.5，碘则取代酪氨酸以外的其它成分。
⑷ 氯胺T的用量必须事先测定。其方法为定出在标记的蛋白质存在时，10%的三氯醋酸能沉淀最大量放射性碘所需要的最小量的氯胺T。氯胺T的用量必须适当。用量少，虽能满足反应的要求，但产率低；用量大易使蛋白质变性。
⑸ 蛋白质的浓度决定碘化的效率。对含量中等的氯胺酸的蛋白质而言，在蛋白质浓度为1mg/ml，蛋白质的回收率为100%，浓度为300μg/ml，则为80%～90%，当浓度降至50μg/ml时，则回收率只有60%～70%。
4．标记物的鉴定
⑴ 放射性化学纯度鉴定是指某一化学形式的放射性物质的放射强度在该样品中所占放射性总强度的百分比。鉴定方法为：取标记的蛋白质或多肽抗原液少许，加入1%～2%载体蛋白及等量的15%三氯醋酸，摇匀静置数分钟后，3 000r/min离心15min分别测上清液(含游离碘)及沉淀(含标记抗原)的放射活性。一般要求游离碘含量占总放射性碘的5%以下。标记抗原贮藏较久后，仍有部分放射碘从标记物上脱落下来，使用时应除去后再用，否则影响放射免疫分析的精确度。
⑵ 免疫化学活性鉴定：采用碘标记的抗原，通常由于氧化剂的作用可引起部分活性的损伤，而采用3H、14C等标记的抗原，则不改变抗原的化学结构。免疫活性的检查方法：以小量的标记抗原加过量的抗体，在适当的条件下充分反应后，分离B、F，分别测定其放射性，算出百分结合率。此值应在80%以上，最大可超过90%。该值越大，表示标记的免疫化学活性损失越少。
⑶ 放射强度：放射性强度以比度表示。即单位重量抗原的放射性强度。比度越高，敏感性越高。因此根据测定需要的敏感度，要求适当比度的标记抗原。标记抗原比度的计算是依据放射性碘的利用率。

（五）B、F分离 
当标记的抗原与未标记的抗原和抗体结合后，均形成抗原抗体复合物。由于其浓度低，不能自动沉淀。而放射免疫测定的终点决定于标记抗原与竞争者的结合比，因此将抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离得完全与否是放射免疫测定的关键。
分离技术的选择是根据抗原的特性、待测生物液体的体积、测定需要的敏感度、精确性以及技术上可达到的熟练程度等。
表  B、F分离法
分离方法 (B)
抗原抗体复合物 (F)
游离抗原
平衡透析
清蛋白或葡聚糖衣
活性炭吸附
凝胶过滤
微孔滤膜过滤
电泳和层析电泳
双抗体法
固相抗体法
硫酸胺沉淀法
聚乙二醇(分子量6 000) 在透析袋内
不被活性炭吸附离心
后于溶液中
先被洗脱
在醋酸纤维膜上
在 球蛋白电泳带
被第二抗体沉淀
结合到固相物上
离心后于沉淀中
离心后于沉淀中 袋内外浓度相等
被活性炭吸附于沉淀中

后被洗脱
通过滤膜被洗掉
以其自己的电泳泳动度移动
离心后在上清液中
在溶解相中
在溶液中
在溶液中
1．盐析法  利用33%饱和硫酸铵液可使其抗原抗体复合物沉淀下来。向溶液内加入饱和硫酸铵，使其最终饱和度达到36%左右，摇匀静置，然后离心沉淀即为标记抗原抗体复合物，而游离的标记抗原仍留于溶液中。此法的缺点是，游离抗原也同时有随标记抗原抗体复合物沉淀的可能。
2．双抗体法  双抗体法是目前常用的方法，抗体在与标记抗原结合后，同时还具有对抗抗体的结合能力，因此用第一抗体动物的提纯的免疫球蛋白去注射另一种动物，获得第二抗体(即抗抗体)。当第一抗体与标记抗原形成复合物时再遇上第二抗体即形成 *Ag－Ab1－Ab2(也有Ag－Ab1－Ab2)更大的复合物而沉淀下来。达到与游离的抗原分离的目的。此法比较温和，分离也较完全(可达80%～90%)。
3．清蛋白(或葡聚糖衣)活性炭吸附法  是将活性炭悬浮于一定浓度的葡聚糖水溶液中(或清蛋白)，葡聚糖分子在活性炭表面形成一层具有一定孔径网眼的膜，这层膜只允许较小的分子吸附于上面，进而被活性炭所吸附，大分子的物质被排在门外，不被活性炭吸附。从而达到分离的目的。最佳分离条件是pH6.5～9.4℃，15min～30min。
此法快速、方便而且分离效果好。但是当标记抗原与抗体结合不牢固时，待游离抗原被活性炭吸附后打破了抗原抗体反应的平衡，而造成抗原抗体复合物的离解。在这种情况下，此法不能应用。
（六）标准曲线的制作 
标准曲线的制作直接影响到放射免疫测定的敏感性、精确度和工作范围。

同位素标记是一种重要的抗体标记技术，1977年Yalow等在放射免疫测定法所作突出贡献而获得医学和生理学诺贝尔奖。McAb标记同位素后除应用于放射免疫测定外，还可用于竞争结合试验、体内肿瘤定位等。

　　(一)　原理
氯胺桾即对甲苯碘氯胺钠，在水溶液中生成次氯酸，为一种温和氧化剂，当加入到有蛋白质和碘的弱碱水溶液中，可将I２氧化为I＋并结合到氨基酸上。如标记条件温和，标记后的McAb仍具有良好的结合活性，通过放射性同位素强度的测定可反映相应抗原的含量。

　　(二)　方法
　　　　　　在细胞冻存管内加入纯化的McAb100μg／100μl，
　　　　　　再加入10μl 0.05M磷酸缓冲液
　　　　　　再加入10μl(含1mCi)125I
　　　　　　　　　　↓
　　　　　　加入10μl氯胺-T(5mg／ml溶于0.05M
　　　　　　磷酸盐缓冲液)，孵育时间不超过30秒
　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　加入100μl偏重亚硫酸钠(1.2mg／ml溶于
　　　　　　0.05M磷酸缓冲液)
　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　加入200μl　KI溶液(少许结晶KI溶于0.05M
　　　　　　磷酸缓冲液＋4％牛血清白蛋白)
　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　用PD10柱(Sephadex G25)除去游离125I
　　　　　　用4％BSA　PBS洗脱
　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　分部收集，0.5ml／管
　　每管取5μl进行γ计数，计算标记抗体的比活性和标记率
　　　　　　　　　　　结合于McAb１２５I放射性强度(cpm)
　　　　标记率(％)＝───────────────────
　　　　　　　　　　　　　　总放射性强度(cpm)
　　　　　　　　　　　　　　　　结合于某一管McAb上的放射性强度
　　　　比活性(μCi／μgMcAb)＝────────────────
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　某一管McAb总量

　　(三)　试剂器材
　　1.　纯化后的McAb
　　2.　0.05M磷酸缓冲液，氯胺桾，偏重亚硫酸钠，KI，BSA
　　3.　125I
　　4.　有通风装置的超净台，γ计数仪
5.　PD10柱(Sephadex G25)

　　(四)　注意事项
　　1.　严防同位素污染，工作人员必须穿着工作衣，戴口罩、帽子、手套。必须在严密的通风橱或通风超净台中操作。操作前后对实验室环境进行监测。所用125I和标记物应妥善保管。
　　2.　如标记细胞因子、激素等，应选用更温和的标记方法，使保持更好的生物学活性。

（一）材料及试剂
1．胰岛素标准品(不同浓度的)
2．125 I－胰岛素
3．抗血清
4．第二抗体
5．分析试剂  为0.05 Mol/L pH7.4 PBS液＋1％正常兔血清。
6． －计数仪
7．试管、加样器、离心机等
（二）操作方法：
1．按表进行。
表 胰岛素RIA测定方法(单位：μu/ml)
 标准管 待测管
 0 10 20 40 80 160 1 2
试管号 1，2 3，4 5，6 7，8 9，10 11，12 13，14 15，16
标准品(不同浓度) 100 100 100 100 100 100 
待测血清       100 100
抗血清(二抗) 100 100 100 100 100 100 100 100
分析试剂 100 100 100 100 100 100 100 100
混匀，37℃温育2h
125 I－胰岛素 100 100 100 100 100 100 100 100
混匀，37℃温育1h
第二抗体 100 100 100 100 100 100 100 100
混匀，37℃反应30min
2．测定和计算  反应完毕后，将各管于室温3 000 r/ min离心30min，仔细吸取上清液，收集于放射性废液贮存容器内。用 －计数仪分别测量各管沉淀物(B)的放射性强度(cpm)，以两管的cpm均值表示。再以第1，2管的cpm值为Bo，分别计算结合率(B%，即B/Bo×100%)，用B%为纵坐标，不同浓度胰岛素标准品为横坐标，绘制标准曲线。然后根据待检管的B%，从标准曲线中即可查得胰岛素的相应含量。

（一）原理  IRMA是采用过量的标记抗体与待测抗原的非竞争性结合反应，然后加入固相的抗原吸附剂以结合游离的标记抗体，离心去沉淀，测定上清液中的放射性强度，从而推算出待测样品的抗原含量。
（二）放射免疫检测与免疫放射检测(即IRMA与RIA)的区别 
表   IRMA与RIA的区别
 IRMA RIA
标记物质 抗体 抗原
标记物用量 过量 限量
反应方式 直接结合 竞争性结合
B、F分离方式 固相抗原免疫吸附剂 第二抗体等
（三）标记抗体的制备 
特异性抗体的制备，质量要求及125I标记方法与RIA基本相同。抗体IgG分子中含有多个氨基酸残基，经过碘化反应后，不影响其免疫学活性，并能结合上较多的碘原子，标记物的比放性高，克服了RIA中某些抗原不易标记，或在标记过程中容易发生化学或放射性损伤等缺点。同时纯化的抗体比抗原的纯品来源更为丰富。标记抗体的方法比较单一，也易于掌握，不同于标记抗原，每一种抗原必须标记一次，且抗原复杂，多种多样，标记方法也多种多样。如果将抗体分子酶解成Fab片段，形成单价抗体，再进行标记，这样其敏感性将显著高于一般的IRMA。
（四）免疫吸附剂的制备 
免疫吸附剂是将高纯度的抗原连接在固相载体上而制成。所用固相载体要求对抗原的结合力强，对非特异性蛋白质的吸附性能低，且具有高度的分散性，这样才能大量地结合特异性抗体。一般采用重氮化的纤维素、溴化氰化的纤维素、琼脂糖4B珠、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶和玻璃粉等作为抗原吸附剂的固相载体。
近年来发展建立的双抗体夹心IRMA法，用固相抗体代替抗原免疫吸附剂，反应后形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，经过洗涤即可除去游离的剩余标记抗体，简化了分离步骤，并保证了较高的特异性。
固相抗体的制备方法有两种：一种是物理吸附法，将塑料小珠浸泡在稀释的抗体中，用前经过洗涤即可。或者将抗体吸附在塑料试管中；另一种是采用化学连接法，将抗体较牢固的结合，这样洗涤时不易脱落，塑料小珠浸泡的条件是50mMol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，抗体的浓度为IgG 0.1μg/ml～100μg/ml。塑料试管吸附抗体的条件是抗体浓度0.1μg/ml～100μg/ml 37℃、4h～6h或4℃ 24h。
（四）测定方法
根据试验设计的特点，可分为以下几种类型。
1．直接IRMA法  将待测抗原与过量的标记抗体进行温育，使二者结合。然后加入固相抗原免疫吸附剂再次温育，吸附游离的标记抗体。离心去除沉淀物，测定上清液中放射性强度。根据标准曲线即可得知待测样品中的抗原含量。
2．双抗体夹心IRMA法  在待测抗原内依次加入固相抗体(或将待测品直接加入抗体包被管内)和标记抗体，反应后形成固相抗体(Abl)－抗原－标记抗体(Ab2)复合物。洗涤除去未结合的游离标记抗体。测定固相抗体或载体上免疫复合物的放射活性，根据标准曲线求得待测得抗原量。此法仅适用于检测有多个抗原决定簇的多肽和蛋白质抗原。
3．间接IRMA法  此法是在上述双抗体夹心法的基础上，进一步改良为125I标记Ab2的抗体，反应形成的固相抗体(Ab1)－抗原－Ab2－标记抗体(﹡Ab3)的四重免疫复合物。其中标记抗体(﹡Ab3)可做为通用试剂，由于同种Ab2的各种IRMA，省去了标记针对不同抗原的特异性抗体。
4．BAS－IRMA法  是将生物素－亲和素系统引入免疫放射分析，建立了新一代IRMA。此法的最大优点是使用生物素的抗体和以125I标记亲和素为示踪剂，可以通用于甾体类、甲状腺素、前列腺素等多种分子物质的检测。固相半抗原结合物经过无水乙醇处理，结合非常牢固，可长期保存；反应和测定在同一试管内完成，操作十分简便，适用于IRMA技术自动化检测。

（一）材料及试剂
1．标记抗体
2．固相抗原免疫吸附剂
3．标准抗原或待测物标准品
4．待测标本
5．洗液0.05Mol/L pH7.4 PBS液
6． －计数仪、低温离心机等
（二）操作方法
1． 加入各样品，并进行操作。
2．测定和计算  用 计数仪分别测量各管的放射性强度(cpm)，取各管的平均值计算结合率B/T％。以B/T％为纵坐标，TSH标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据待测样品管的结合率以标准曲线中即可查知待测样品中的TSH含量。