一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化,不同点如下: 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理,封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育,孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油:0.01M PBS (1:1)。条件许可,建议购买抗淬灭的封片液,使标本可以保存更久。 5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多,需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长,可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照: (1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照:阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时,要求来源于两种不同的动物,我用的是来源于家兔和大鼠的抗体,二抗则是不同荧光信号标记的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索,我感觉一抗4℃孵育过夜比较好,背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片,阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清,我用的是10%正常donkey血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 |
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