一、原理 在酸性条件下( pH4.5),非1gG的蛋白成份(包括白蛋白,部分Ig),能被辛酸等短链脂肪酸沉淀,上清中剩余的蛋白主要为IgG,再用硫酸铵沉淀上清,即可获得纯度较高的IgG。辛酸/硫酸铵法比硫酸铵法能够获得更高纯度的IgG。 二、材料与方法 1、材料 (1)动物腹水 (2)辛酸(caprylic acid,CA),化学纯 (3)硫酸铵,分析纯 (4)SPA Sepharose 4FF亲合层析柱 2、操作方法 (1)蛋白含量测定 紫外分光光度法测样品在波长260nm,280nm处的I及收光度(A 260, A 280),蛋白含量按以下公式计算 蛋白量(g/L)=(1.45* A 280- 0.74* A 260)*稀释倍数 (2)主要步骤 ①腹水滤纸过滤去沉淀和脂质,滤液用4倍体积60mmo1/ L醋酸缓冲液(pH4.0)稀释后,用Na0H调,PH值至4.5。 ②逐滴加入辛酸(终浓度25u1/ml),室温h搅拌30分钟后,以6000-8000r/min.离心30分钟,收集上清液。 ③上清液经滤纸过滤2次,将滤液与10*PBS(0.lmol/L,pH7.4按10:1比例混合,调pH至7.4,置冰浴冷至40度。 ④每毫升上述混合液加0.2778固体硫酸钱,40度搅拌30分钟,以4000-6000r/min离心巧一20分钟,将沉淀溶于少量YBS,透析,测蛋白含量,冻存。 (3)硫酸铵沉淀法 按常规方法将腹水分别经50%,33%饱和度硫酸铵沉淀。 (4)亲合层析 取提取的样品,用0.01lmol/ L Na2HPO4 (pH7.4)透析,洗脱使样品中IgG结合于层析柱上,再用0. lmol/ L柠檬酸(pH4.0)洗脱,收集洗脱液即获纯化IgG。 (5)SDS—PAGE电泳鉴定抗体纯度 (6)间接ELISA法测定抗体效价 用sIgA包被酶标板,按常规方法测抗体效价。处理细胞,包被酶标板,测定抗体效价。 (7)得率和回收率的计算 每毫升原腹水中提取的抗体量即为得率(Y field,g/ L );提取所得抗体量与原腹水中抗体量之百分比即为回收率(Recovery,%)。 |
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