5、研究神经递质的超微结构定位

应用免疫电子显微镜技术（常用为PAP法或胶体金标记技术）可显示抗原在神经细胞内的超微结构定位及在突触水平神经元间的联系的化学本质。Pickel应用免疫电镜观察证明TH存在于DA和DA能神经元的细胞体、树突和近侧轴突。在胞体内此酶定位于内质网、Golgi器和微管上。神经终末枝的突触小泡一般认为是神经递质的亚细胞贮存部位，在电镜下观察神经末梢内突触小泡呈现不同形态，目前已有文献报道的近10余种，比较常见的为无颗粒小泡型（Small agranular vesicles，SAV）或称清亮小泡型（Small Clear Vesicles，SCV），其直径50～90 nm，中心无颗粒；该型常混有不同比例含致密核心的大囊泡，直径80～150 nm。其次是颗粒小囊泡型（Small granular vesicles, SGV），直径45～70 nm，内含有电子密度高的致密核心。第三是大颗粒泡型（large granular vesicles，LGV），直径80～160 nm的突触小泡内含有电子密度高的致密核心。其它还有扁平囊泡型、线粒体型等。是否不同形态的突触小泡代表了含有不同种类的神经递质尚有争论。有学者认为不同形态的突触小泡只是使用不同种类固定液的人工假象，然而越来越多的实验证明表明，固定液的种类固然有一定影响，但神经终末突触小泡的形态和内含递质的种类似乎存在一定的相关性，SAV型是取得比较一致意见的神经终末类型，它和骨骼肌运动终板（也是神经—肌肉的突触）内所含突触小泡的形态相一致，后者已证明为乙酰胆碱神经递质的贮存处，细胞化学示Ach阳性反应，电刺激时突触小泡减少，示释放现象。这种类型的突触小泡内可能含有乙酰胆碱。

SGV型一般认为是单胺介质的贮存部位，单胺类介质。包括儿茶酚胺和吲胺二种，属于前者的介质有去甲肾上腺素、多巴胺、肾上腺素、属于后者的介质为5-HT。在常规电镜生物样品处理的过程中，小颗粒囊泡不易显示，须应用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）配制的3%高锰酸钾溶液（Richardson1966）或铬酸盐/重铬酸盐溶液（Tranzer 1976）固定，方能获得满意结果。认为SGV是单胺递质贮存部位的根据是：用利血平注射能使小泡内致密核心消失，而用伪介质（Pseudo-neurotransmitter）如5-羟多巴胺（5-OHDA）注射动物，由于伪介质能置换内源性单胺而被吸收和贮存于突触囊泡中，末梢中小颗粒囊泡的数目增加，电刺激交感神经可使小颗粒囊泡减少，而将α甲基去甲肾上腺素给予被拟交感神经药物或被电刺激耗竭了介质的动物，其神经末梢中的小颗粒囊泡又可重新出现。但1982年Wilson等应用多种实验证明，至少在小肠肌间神经丛内，肾上腺素能神经的终末支是扁平无颗粒囊泡型（flat agranular vesicles, FAV），而不是SGV型。1965年Taxi在两栖类动物的肠道中发现含大颗粒囊泡的神经终末支LGV，Baumgarten（1970）在哺乳动物肠道也发现了LGV型神经终末支，因其形态与丘脑下部含肽的神经末支相似，故命名为P型神经终末支，意即肽能神经（Peptidergic nerves）终末支，而有作者认为凡是颗粒囊泡，包括SGV和LGV都是单胺类递质的贮存部位。免疫电镜技术部分地解决了这一争论。应用PAP和胶体金免疫电镜技术证明VIP、SP、降钙基团相关肽（CGRP）和神经肽Y（NPY）等多肽类物质确实定位于大颗粒囊泡中（Larsson 1976, Bishop 1982, Probert et al. 1983）。有作者还认为不同种类的多肽分别被包含于不同直径的大颗粒囊泡中，如SP定位于直径85 nm的大颗粒囊泡中；VIP：囊泡直径98 nm；ENK：囊泡直径110 nm等，但不同作者在不同动物种属和不同组织、应用方法不同报告结果各异，难以结论。Fried（1985）应用免疫组化、电镜技术和密度梯度离心法相结合，证明在大鼠输精管神经终末支小颗粒囊泡中含有NA，而大颗粒囊泡分为三种类型：单纯含NPY或NA，或NA与NPY共存于一个囊泡中。Burnstock还提出直径100～200 nm的大的不透明囊泡（LOV型）系嘌呤能神经递质的贮存部位，神经终末支内全为线粒体所充满的可能属感觉神经终末支。凡此种种，都说明虽然免疫电镜提供了神经递质超微结构水平定位定性的可能，但神经终末内突触小泡的形态与神经递质种类之间的关系始终还有待于进一步的研究。如SAV型在外周可能是代表胆碱能神经的终末支，在中枢能否说SAV内所含的都是乙酰胆碱，其它各型的突触小泡内所含神经递质的种类也还需要进一步研究。在技术方法上的运用，根据笔者体会，应用免疫电镜PAP法，免疫反应复合物相当大，有时很难准确地判断免疫反应复合物的定位，因在囊泡基质内和囊泡膜上雹有反应物附着，免疫胶体金电镜技术避免了上述缺点，胶体金颗粒的沉积比较集中于囊泡基质内，在递质超微结构定位的研究上似较PAP法优越。

6、神经递质共存的研究

免疫细胞化学在神经科学的运用打破了传统的一个神经细胞只产生和释放一种神经递质的概念。在中枢和周围神经系统，近年来，有较多的实验报告证明在一个神经细胞内存在两种或两种以上的递质，这种递质共存不是偶然和个别的现象，而是一种带普遍规律的问题。在光镜水平显示神经细胞内两种抗原的共存，其分辨率只限于胞体，观察神经纤维内两种抗原的共存，必须借助免疫电镜技术。共存情况可出现于：（1）经典神经递质间，如在大鼠颈上交感神经节的相邻照片上，同一神经细胞分别显示NA和ACh阳性；（2）经典递质与单胺类递质间，如在松果体交感神经末梢中，不仅含有NA，而且含有5-HT；（3）经典递质和神经肽间，如在大鼠的椎前神经节中，大约有60%的NA能神经细胞同时显示SOM免疫反应阳性，说明SOM与NA的共存，在交感神经系统中NPY与NA的共存，在副交感神经系统中VIP与ACh的共存，已得到较为普遍的证实；（4）单胺类递质与神经肽的共存，如大鼠输精管的交感神经终末支中NA与NPY的共存，在豚鼠肠道肌间神经节中5-HT与SP免疫反应物共存一个神经细胞内；（5）神经肽间的共存，如SP与CGRP常共存于感觉神经终末支，Gibbins等（1987）在豚鼠背根神经节　细胞中证明SP、CGRP、CCK和强啡肽（Dynorphin，DYN）四种神经肽的共存。对于神经递质共存的亚细胞部位，Hokfelt曾对肽和胺的共存提出了一种假说，即：①它们可分别贮存于同一神经终末内的不同形态的突触小泡内；②共存于大颗粒囊泡和小颗粒囊泡内；③仅共存于小颗粒囊泡中；④仅共存于大颗粒囊泡内；此假说尚待进一步证实。Fried的实验结果表明，在大鼠输精管，胺和肽的共存仅发生于大颗粒囊泡内，Andrzejloesch和Burnstock实验证明在豚鼠肠道肌间神经丛内VIP和ACh共存于SAV小囊泡内。应用胶体金免疫电镜技术，以不同直径的金粒标记不同的抗原，是研究递质共存的超微结构定位较为理想的手段。

关于递质共存的生理意义，目前还不十分清楚，有作者设想与经典递质共存的肽类可作为辅递质，在神经细胞释放时，对突触后膜上主递质的受体起调制作用，从而调制信息传递。Hokfelt（1980）提出两种递质共存的生理意义有以下五种可能性：①两种递质可穿过突触间隙作用于突触后细胞，作用于相同或不同的受体；②一种物质激活突触后细胞的受体，另一种物质则封闭另一种类型的受体，如在5-HT和SP共存的情况下，5-HT直接抑制突触后细胞，SP封闭其它末梢释放的ACh对突触后的细胞的兴奋作用；③一种物质作用于突触后细胞，第二种物质则作用于突触前末梢的自身受体（autoreceptor），从而调制细胞终末对神经递质的释放；④一种物质作用于突触后细胞，第二种物质则作用于其它末梢上的突触前受体；⑤一种物质作用于一类细胞，另一种物质作用于另一种细胞，在这方面典型的例子是汗腺，汗腺的交感神经元内含有VIP和ACh，前者作用于周围小血管，增加血流量；后者作用于腺体，刺激汗腺分泌。

总之，递质共存的研究是神经科学领域中一个崭新的课题，它的研究对进一步了解复杂的神经系统的结构和功能有重要意义，而在这项课题的研究中，免疫细胞化学（包括光镜和电镜）无疑是一项有力的工具。

7、个体和种族发育的研究

神经系统是一个历史发展的产物，有种族发育和个体发育的历史。在种系发生方面，有不同的发育规律，如一些神经肽自腔肠动物已经发生，而VIP自鱼类才开始发生。免疫反应的强弱和神经肽的含量亦因种属不同而异，如笔者对输精管的神经支配的研究表明，在大鼠、豚鼠和猫等动物，输精管管壁内有丰富的神经分布，而在人输精管神经分布异常稀疏。研究神经肽的发生可以帮助了解肽类的发生规律，有利于选择和建立实验动物模型。个体发育，不但指胚胎发育，也指动物出生后发育以至衰老的规律，神经系统的任何一个部分都可以从发育的角度去研究。在肠道，Epstein等在鸡小肠壁内神经丛的研究表明，在鸡胚发育的第7日出现胆碱能神经成分，5～7天出现5-HT神经细胞，NA神经终末出现于第12～16日，神经肽出现在这些递质之后。在小鼠、豚鼠和兔小肠壁内神经从发育规律的研究报告和鸡相似。神经肽的出现较晚，而神经对肌肉发育的作用更晚，如在豚鼠小肠，虽然在胚胎第25日出现了胆碱能神经细胞，但肌肉对神经的反应性出现在胚胎的第48日。各种神经肽的含量和含肽类神经细胞的数目都随发育、成长、衰老而产生规律性变化，如大鼠全脑或脑各分区中NSE的含量随发育而增高，在第13天胚胎时NSE含量为50 ng/mg蛋白质，到成体（第40日）时为11000ng/mg蛋白质，而定位于神经胶质的非神经无烯醇酶（No-neuronal enolase, NNE），在第11日的胚胎为8500ng/mg蛋白质，出生后下降至5000 g/mg蛋白质，到成体（第60日）时为11000ng/mg蛋白质。以上结果表明，随着神经细胞的产生，NSE增加，而NSE/NNE比例显著增高，说明在大鼠脑神经元的分化过程中可能存在着由NNE转变为NSE的生物化学分子变化。杨恬、蔡文琴等（1994）报告了六种肽能神经在人胚胎期的发育规律，AChE神经出现最早，其它肽能神经出现时间不一，分别在第11～16周。同一个体不同器官肽能神经并非同时发生，如膀胱肽能神经出现较小肠为晚。总之，神经系统种族发育和个体发育这个领域的研究还有待于进一步发掘。

8、与神经组织培养技术相结合进行神经生物科学的研究

神经组织培养是从机体中取出组织或细胞，在模拟机体内生理条件下进行体外培养。免疫细胞化学技术可用于培养的单个细胞或组织片染色，单个细胞可直接固定或冰冻后进行免疫染色，而组织片在固定或冰冻后常需进行切片后染色。由于体外神经组织培养技术能使复杂的神经系统简单化，换而言之，能在神经系统的结构与功能的研究方面提供一个简单的模型，近年来，随着培养技术的发展和与其它科学的相互结合，在神经生物学这一研究领域中提供了不少的新资料，如利用免疫细胞化学技术可对原代分离培养的神经细胞和神经胶质细胞进行细胞的特异抗原标记（可以是细胞表面或细胞质内成分），从而区别其细胞类型，如用GFAP标记星形胶质细胞、半乳糖脑苷脂、髓磷脂碱基蛋白（myelin basic protein，MBP）标记少突胶质细胞、NSE标记神经细胞、Ran-α标记胶质细胞表面的抗原等，这些特异的标记在神经生物学和临床科研中有很大潜能，细胞表面标记能够区别活细胞，精确地研究细胞间特性和相互作用，细胞内标记能有助于对神经细胞结构、功能及相互作用的研究。Mirsky及其同事们利用半乳糖脑苷脂（GC）、硫脂（Sulphatide，S）和MBP对培养的雪旺氏神经胶质细胞和少突胶质细胞的研究表明，雪旺氏神经胶质细胞在与其所依附的轴突分离后不超过5～6天，GC、S和MBP的免疫染色均为阴性，表明雪旺氏细胞需要持续性地从相应的轴索获得信息(Signal)才能制造出可为免疫染色所检测出的髓鞘特异性糖脂和蛋白，而少突胶质细胞则否，在没有神经细胞存在的情况下培养数周，仍保持GC、S和MBP免疫反应阳性。本实验结果成功地证明少突胶质细胞和雪旺氏神经胶质细胞产生髓鞘的方式是不同的。Abney等利用培养的胚胎和新生大鼠的脑细胞混悬液进行特异性免疫标记染色，证实了不同类型细胞在脑内的发育顺序：破伤风毒素阳性神经细胞出现在第10天的胚鼠脑（测试的最早时间），GFAP阳性星状胶质细胞出现在15～16天的胚脑，而GC阳性少突胶质细胞直至出生后2～3天方才出现。利用18天胚鼠的小肠壁内神经丛培养后进行各种神经肽的免疫染色，Schultzberg等发现在这时的小肠壁内神经丛已具有内源性的VIP、SP、ENK和SOM免疫反应性神经元。

9、应用于受体的研究

由于免疫细胞化学所应用的各种标记物如铁蛋白、胶体金和荧光素等都能无例外地与配体（即与受体呈特异结合的物质）相结合，因此可应用于细胞表面（包括神经细胞和神经胶质细胞）表面受体的定位。Philips和Bennet（1987）应用抗肌球蛋白和荧光素标记的α-眼镜蛇毒素成功地显示了乙酰胆碱受体（Acetycholine receptor clusters）在鸟肌上的发育规律。近年来，应用免疫细胞化学技术进行受体再循环的免疫电镜观察，取得了令人瞩目的进展。Geueze利用胶体金-蛋白A-抗唾液酸糖蛋白的受体抗体在免疫电镜下观察证明，配体与细胞表面的相应受体结合后，由受体介导入肠作用而进入胞内，在入胞早期，唾液腺糖蛋白及其受体均存在于有覆衣囊泡中，并与囊泡内表面密切结合。在人胞囊泡内，则见配体游离于囊泡腔中，内移的受体可再循环回细胞表面加以利用。本实验结果为细胞膜受体的再循环提供了有力的证据。

10、神经系统的机能研究

免疫细胞化学在神经科学的应用已由单纯的形态学研究逐步向与机能研究、应用研究和临床实践相结合。如研究脑啡肽与镇痛的关系，SP与转导伤害性刺激的关系以及在各种生理和病理条件下神经肽的变化与病理生理作用机制的关系等。在研究方法上也不断改进，如免疫组化的定量研究由简单的积分法逐步走向与放射免疫测定相结合、与图像分析相结合，测定单位面积内和/或每个神经细胞内免疫反应物含量的变化。