基于膜的检测试剂研发人员应该严格考虑影响蛋白质在硝酸纤维素膜上结合众多因素，其中包括原材料的固有属性和处理过程等。

随着胶体金标记技术的发展、研发人员对胶体金快速检测技术深入研究，市场上基于膜的快速免疫层析检测产品的种类迅速增多。

虽然免疫层析产品的包装设计种类繁多，实际上目前主流的商品化检测试剂盒主要下面两种形式。最常用的检测形式为侧向层析

或者层析定量，这种检测形式通常应用于诊所或者由直销客户检测。另一种检测形式为竖向斑点渗滤，该检测形式需要较强的操作技巧，仅限于研究使用。

不管试剂采用那种检测形式，灵敏、可重复的检测试剂的生产需要试剂生产商采用有效的途径制备检测线工作液。快速诊断试剂生产商经常对如何优化检测线相关的文章非常感兴趣。这些文章可以有助于研发人员涉及关于蛋白质固着于硝酸纤维素膜基本原理的讨论，并对研发人员在开发免疫层析试剂中面临的常见问题给予强调。由于关于蛋白质吸附于NC膜的问题普遍存在于侧向层析，因此这篇文章重点讨论这方面的问题。

蛋白质吸附的重要性

图1 依靠在膜上适当的结合捕获试剂，用试纸条检测样本可以获得清晰、明显的结果。

在免疫层析检测中，蛋白质固着于NC膜作为待测样本的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对检测结果非常重要（见图1）。

自从NC膜第一次应用于蛋白质吸附以来，已有相当多的关于蛋白质吸附于NC膜的研究，但蛋白质吸附于NC膜的确切作用机理仍然不能确定。虽然多种作用力在结合中起到作用，尤其比如疏水力、氢键、静电作用，但是每种作用力的重要性和明确的效果仍然让人难以琢磨。目前有两种比较合理的作用模式。第一种模式认为，蛋白质最初通过静电作用被吸附到NC膜表面，而长期的结合作用是通过氢键和疏水作用完成的。虽然这一原理难以证明，但与已发表的文献实验结论一致，也是最为接受的作用机理。

图2 本检测结果中的捕获线有代表性的反应了蛋白吸附问题

表2 在这几个例子中，样品检测结果的检测线存在明显的蛋白质结合问题。

第二种模式认为，蛋白质首先通过疏水相互作用结合到NC膜上，通过静电力牢固地与NC膜结合则。该结合模式同大量已发表的文献结果一致，然而静电作用机理对于采用干燥或乙醇吸附方法到达的蛋白质长期稳定的吸附于NC膜上无法提高合理的解释。

不管蛋白质结合的作用力如何达到平衡，研究人员在优化蛋白质吸附于特定的NC膜时，必须综合考虑所有影响蛋白质吸附的作用力。这一观点不可避免的影响着试纸条板材的选择及其处理工艺。例如，如果产品开发人员选用可以极度降低静电相互作用或者疏水相互作用的缓冲液，那么蛋白质的吸附能力则剧烈的降低。同理，蛋白质点膜后充足地干燥对于确保蛋白质长期稳定地固着于NC膜非常重要。

生产商选用的材料能够有效地将蛋白吸附于NC膜上。影响蛋白质吸附于NC膜的材料通常有3种类型：非特异性的蛋白质、影响静电相互作用以及疏水相互作用的物质。常见的能够降低蛋白质结合的物质包括竞争蛋白质结合位点的其他蛋白，如BSA、动物血清，干扰氢键的形成物质（如甲酰胺、尿素），影响疏水作用形成的物质（如Tween、Triton、Brij）。人工合成的结合物比如聚乙烯醇、聚乙二醇以及聚乙烯吡咯烷酮也可以影响蛋白质的结合，它们的作用机理可能是抑制一个或者多个蛋白质与NC膜结合的共同作用的结果。

如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，在检测结果的检测线上非常明显（见图2）。如果膜上结合的蛋白量太低，那么在结果中检测线显色较弱而且检测灵敏度降低（见图3）。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。

图3 弱的捕获线反应了吸附于膜上的蛋白量很低

图4 流过的待检蛋白和表面活性剂溶液洗掉NC膜吸附的捕获蛋白导致检测结果出现扩散的检测线。

体外诊断试剂研发人员经常遇到上述问题，而且这些问题明显地延长了免疫层析检测试剂的研发周期。为了了解如何解决上述问题，研究人员首先应该牢固的掌握影响蛋白与NC膜结合的各种因素，包括材料的固有属性及其检测前的处理过程。本文的第一部分就这些问题进行讨论，第二部分主要介绍在技术上如何解决这些问题（待发表于IVD技术杂志）。

影响蛋白质吸附的因素

当研究蛋白质捕获剂结合于NC膜时，研发人员应该考虑下面五个影响蛋白质结合作用机理的每一个关键因素。

Ø 溶解捕获蛋白的工作缓冲液；

Ø 用来固着捕获蛋白的NC膜；

Ø 捕获蛋白自身；

Ø 将捕获蛋白点样于NC膜的系统；

Ø 捕获蛋白点样时的环境湿度。

虽然很多研发实验室对于免疫层析检测中使用的工作缓冲液和膜的特性进行了充分的研究，但他们不可能全面的研究或优化他们使用的系统和捕获试剂。这些忽略的步骤通常由于在开发之前就已经考虑恰当，因此在开发中很少有机会进一步调整。由于疏漏了对那些因素优化，研发人员常常集中精力优化他们认为必须优化的方面。

捕获剂 随着检测项目的不同，作为捕获剂的蛋白质各不相同。即便捕获剂差异的稍微，也没有一个捕获剂与另外的捕获剂完全相同。不同的蛋白捕获剂对不同膜的吸附能力不同，或许这一因素至关重要（见图5）。单克隆抗体作为较均一的蛋白捕获剂，优化与NC膜的结合过程较为简单，而多克隆抗体由于含有针对大量不同的抗原决定簇的抗体，不同抗体的最佳结合条件可能稍微不同，从而导致蛋白与膜结合条件的优化过程较为复杂。比如IgA、IgM存在结构或者空间位阻等因素，其与膜结合条件的优化过程较为困难。比如BSA、A蛋白以及G蛋白由于化学性质或者分子太大较易吸附于固相载体，从而非常难将其吸附于NC膜。

图5 IgG、白蛋白与不同厂家NC膜结合能力的比较。

仪器设备 捕获剂喷涂系统仍然存在某些问题，大多数商品化可用的（捕获剂喷膜、划线）仪器设备各有利弊。其可变参数包括能否喷涂给定的体积，能否触及条、垫或膜，喷涂速度以及喷涂后处理过程。体外诊断试剂生产商需要的最佳解决方案即为找到能够最有效地解决实际生产过程中面临的问题，比如原材料问题、生产能力问题。优化其他因素也可以优化特定的捕获线喷涂设备。

环境湿度 点膜时的环境湿度严重影响捕获线的质量，尤其对喷膜系统影响严重。如果空气湿度太低，则NC膜上聚集静电荷，从而导致蛋白质喷涂于NC膜表面时容易产生斑点，NC膜表面容易产生疏水斑。如果空气湿度太高，导致NC膜对捕获蛋白的毛细作用加强，从而容易引起捕获线变宽或者扩散。通常情况下，最佳的点膜环境相对湿度应保持在45-65%。为了确保原材料的均一性，点膜前应根据相应试验确定的最佳平衡时间将NC膜在工作环境中平衡。

工作缓冲液的优化 由于蛋白质捕获剂千差万别，不同蛋白的最大结合量工作缓冲体系各不相同。影响点膜工作缓冲液的重要因素有两个。

Ø 蛋白质的可溶性（即用于吸附于NC膜的蛋白量）；

Ø 蛋白质分子的稳定性（即倾向于聚集或溶于水）

为了确保足够的蛋白喷涂捕获线，首先必须将捕获蛋白溶解于点膜缓冲液，而点膜缓冲液维持一定的离子浓度可以确保蛋白的可溶性。尽管点膜工作液具备一定的离子强度有助于控制捕获剂的PH值，但也可以干扰蛋白质结合的静电相互作用。因此，确定维持足量的捕获蛋白浓度的最低可能离子强度至关重要。

如果特定浓度的蛋白质分子在溶液中稳定，那么就会溶解于溶液中。但是如果它的能量状态有利于形成固体，那么吸附到NC膜上的蛋白量多于稳定溶解在溶液里的蛋白量。采用破坏稳定剂或者沉淀剂能够诱导产生这种能量状态，但是如果诱导过度也可能引起其它的问题。如果蛋白在点膜以前沉淀，那么整个试剂系统就高度不稳定且几乎完全不可重复性，导致剩余的吸附到NC膜上的溶解蛋白量剧烈减少，而且沉淀物也可造成诸如堵塞喷涂设备管道或者NC膜微孔等问题。在某种情况下，点膜过程中为了达到适量的蛋白吸附必须将蛋白质处于不稳定状态，有些情况也有例外。

上述分析表明，通过调整蛋白喷涂工作缓冲系统的属性能够改变蛋白质与NC膜的结合作用，其中核心属性涉及缓冲液的离子强度、酸度及所用沉淀剂浓度。

离子强度 在给定的离子强度范围内，蛋白质溶解度随着工作缓冲液中盐浓度的增加按比例增加。为了降低溶液中捕获蛋白分子的稳定性，溶液的离子强度应该尽可能低，这样可以增加蛋白质与NC膜结合的速度。同时，研发人员也应该注意，高浓度盐能够引起蛋白沉淀，而且喷膜后的干燥过程中大量的盐能够干扰检测试剂的稳定性和灵敏度。

酸度 点膜工作液的PH值相当显著的影响蛋白质与NC膜的结合效果。通常蛋白质在等电点时的溶解度最低的。因此，研发人员为了降低溶液中捕获蛋白分子的稳定性，将捕获蛋白的等电点作为理想的喷膜工作缓冲液的Ph值。

共沉淀剂 研发人员通常选择添加不稳定剂或共沉淀剂降低溶液中蛋白质的稳定性来调整喷膜工作缓冲液。IgG的Fc区和F（ab）区对共沉淀剂的稳定性不同，而且Fc区结构更可能被共沉淀剂降解，部分不稳定的Fc区导致更多在正常情况下隐藏在蛋白质内部的疏水基团暴露。因此，不管那种蛋白质与NC膜的结合机理被接受，由于采用共沉淀剂增加的蛋白质疏水性将提高蛋白质与NC膜的结合能力。

图6 采用不同缓冲液以1mg/ml 鼠IgG划线的检测结果

最常用的共沉淀剂时醇类，醇类有许多理由值得推荐。醇类的存在有助于NC膜的重湿润，减少NC膜可能带有的静电，而可以降低溶液中的蛋白质稳定性。在基于膜的免疫分析中，3-5%的甲醇可以极大地提高检测性能。

在几年前，将醇类提高蛋白质与固相载体的结合性能应用于ELISA微孔板生产中，而现在这方法已经作为标准的操作规程。脂肪醇对NC膜结合蛋白的影响发表于1980年，加1%异丙醇作为固定剂在western blotting 实验广泛应用。

虽然其他物质如硫酸铵等作为沉淀剂有时也有很好的效果，但是它们通常不如醇类，这类型的试剂浓度稍微的变化都会严重影响蛋白质的沉淀效果。鉴于这种原因，通常不会使用醇类以外的其他共沉淀剂。

综上所述，新产品开发的喷膜工作缓冲液为：10mM PH7磷酸缓冲液+3%甲醇。虽然这种缓冲液不是所有蛋白质的最佳工作液，但它为开发过程提供了一个极好的起始点。

膜对蛋白质结合的影响

在快速诊断检测中，NC膜在三个方面显著影响蛋白质的结合。

Ø NC膜的孔径

Ø 膜的后处理

Ø 膜的类型

由于作为捕获剂的蛋白质种类繁多，没有一种NC膜作为最佳NC膜适合于任何快速检测反应。不同类型的NC膜与蛋白质的结合能力差别较大（见图5），这就意味着任何一个新产品的开发都必须重新筛选膜。另外，对膜等额外优化可能会进一步提高快速检测试剂的性能与重复性。

孔径 研发人员在侧向免疫层析中应谨慎的对待NC膜供应商提供的NC膜标称孔径。膜的实际孔径取决于采用的测量方法，而不同膜生产商采用不同的测量方法，因而两个相同标称孔径的NC膜采用相同的测量方法检测其实际孔径差异显著（图7）。

图7 采用Coulter气孔计检测的NC膜孔径数据

通常在竖向过滤即根据NC膜的厚度检测NC膜的孔径，而竖向过滤测定的膜孔径和类型与侧向过滤测定的膜孔径与类型没有相关性。因此，在侧向免疫层析中，常规方法测定的NC膜孔径与实际孔径有一定的差异。如果NC膜带有塑料底衬，则无法用竖向过滤测定膜的孔径。在这种情况下，供应商提供的膜孔径常常为基于侧向毛细作用进行估计。

研发人员也可以慎重地根据标称孔径区分同一厂家的NC膜，但不推荐采用这种方法区分不同厂家生产的NC膜。尤其对于侧向层析来说，标称孔径不是NC膜蛋白质结合能力的依据，建议研发人员进行新的研发项目前最好筛选最佳的NC膜。

尽管标称孔径实际意义较小，但NC膜的侧向孔径和膜的结构对于NC膜是否能应用于侧向层析有重要的影响。在一定的范围内，NC膜的有效表面积随着标称孔径的减小而增加，从而NC膜的蛋白结合能力随之增加。不同孔径NC膜的近似表面积可以通过各种材料的比表面积率（SAR）进行估计。比表面积率即NC

表I Whatman NC膜比表面积率检测值（BET表面积检测方法检测数值）