1、流式图画十字mark时的依据是：该管的同型对照？还是细胞分群？

2005年的nature上一篇文章是按群分析的，一篇1995年的science是按同型对照来的。

nature的图片，如下：

FIGURE: Identification of subsets of CD^₄+ and CD₈⁺ T cells in a non-human primate (rhesus macaque).a, Naive CD₄⁺ T cells (CD45RA⁺CD95^-)and two subsets of memory CD₄⁺ T cells (CD₄5RA-, or CD₄5RA+CD95+) can be identified in tissues of rhesus macaques6, 20. Before infection, most cells in the blood and lymph nodes are of the naive phenotype; however, acute SIV infection is accompanied by a selective loss of the memory subsets. LN, lymph node. b, CCR5 expression is restricted to memory T cells in both CD₄⁺ and CD₈⁺ T cells.

2、上面的图中，没有说是否用了同型对照，但是看图可以清楚地看到：

a 中的每一个region都不同，比如Inguinal LN中的Day0和Day10，两者的梯形region位置和大小都不同，那么这是根据细胞团吗？应该不是，因为从Day10的梯形region中可以看到，这不是一个细胞团，如何做出来的呢？作者认为，它是根据某个没有列出来的对照做出来的。

Mesenteric LN中也有同样的问题，两者的统计区域不同，为什么还相互比较？分析：应该是做了Day0和Day？的同时期对照，然后根据对照来设定统计region。

而 b 中也是一样，仔细看CD₄的4张图，每个region都不一样，看来是根据细胞团划分的，但是第四张图（空肠淋巴结）是根据什么呢？肯定不是细胞团！它将细胞团从中间切开了！也不是根据上面的几种细胞，因为每种细胞都不同，在流式上没有设置区间的可比性！因此，作者认为它也是根据其（也许是同型）对照来设置的。

是根据细胞团还是同型对照。两者说的都有其基础！

搞流式技术的人当然说根据同型对照，因为流式的基本原理和相关试验的理论原理决定了，用同型对照是必须的，也是正确的！

有学者说用细胞团，作者浅薄地估计是因为多少年的试验经验告诉他，这样做的结果是一样的。但这个应该是局限于老教授的研究范围之内的，比如：做如图的CD分子表达，阴性阳性分得很开，这样应该是荧光干扰不能干扰试验结果了，所以直接按细胞团分开就可以了。从流式的原理来看，也似乎没有什么可以影响这种分法的因素，应该没问题。

但是，如果是表达量比较少的检测物，也许它们离阴性细胞的距离很近，也就是荧光强度略高于阴性对照，如果同时阴性对照局限趋势不好，那么就很难肉眼操作了。这时，用同型对照做出region或者quadrant是最合理并经得起目前理论考验的方法！ 肉眼分不清时，不要强行划分，让对照来处理吧！

3、一个经验丰富的流式技术支持用自已的经验总结如下：

（1）希望结果可信，同型对照必做。

（2）调节补偿使用单标，CD₈最好，因为细胞群分阴性、强阳和弱阳，非常明显。

（3）分析结果

1）分群明显的情况下结合其生物学意义来划分，画十字的话要同时结合密度图，等高线图和直方图来决定；也不一定非要画十字，可以画region，计算其百分比。使用如FLOWJO软件分析最好了。

2）分群不明显的时候，使用同型对照。偶的体会：大部分时候，分群明显根据群划分的marker和分群不显著时用同型对照画的得到的百分比差异比较小。

（4）需要考虑标记了不同荧光素的各抗体结合在同一个细胞上时，空间占位的问题，可能会导致某种抗体无法完全结合。