三、对流免疫电泳实验

对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法。此方法能在短时间内出现结果，故可用于快速诊断，敏感性比双向扩散技术高10-15倍。

血清蛋白在PH8.6条件下带负电荷，所以在电场作用下都向E极移动。但由于抗体分子在这样的PH条件下只带微弱的负电荷，而且它的分子量又较大（为r球蛋白）。所以游动慢。更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。所谓电渗作用是指在电场中溶液对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这样的液体便向负极移动。抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的。而一般的蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用的影响，使泳动速度减慢，但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。这样抗原体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线。

（一）材料

1、诊断血清：免抗人免疫血清

2、待检血清：人血清

3、阴性对照血清

4、pH8.6、离子强度0.05M巴比妥缓冲液配方：巴比妥1.84克，巴比妥钠10.3克，加蒸馏水1000毫升，调pH至8.6。

5、缓冲琼脂板：将纯化的琼脂用PH8.6离子强度0.025的巴比妥缓冲液（用0.05M的巴比妥缓冲液稀释一倍即可）配成1.5%的琼脂，加入0.01-0.02%流柳汞防腐，保存冰箱内备用。

6、电泳仪

7、其他：生理盐水、打孔器、微量进样器

（二）方法

1、琼脂板的制备根据需要可选用大玻板（6厘米×9厘米）和（小玻片）两种。大玻板约需琼脂10毫升，小玻片约需3.5毫升，凝固后按图打孔，方法同琼脂扩散实验。

2、加样：左侧孔内加患者血清（原血清及10倍稀释血清各占一孔），右侧内加抗血清，每片应有阳性对照

3、电泳

用国产普通电泳仪。其内加0.05mPH8.6的巴比妥缓冲液，加至电泳槽高度的三分之二处，注意两槽内液面尽量水平。将加好样品的玻板置于电泳槽上，抗原端接负极，抗体端接正极，用2—4层滤纸浸湿作盐桥，滤纸与琼脂板联接处为0.5厘米。以板宽度计算电流，以板的长度计算电压。要求电流量为2—3毫安/厘米，即大板为20毫安，小板为10毫安。电压为4—6伏/厘米。通电45分钟—2小时后观察结果。

4、结果观察

在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。如果抗原，两极微沉淀条纹不清晰，于37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度。

5、影响结果的因素

（1）抗原抗体的比例：抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带，反之不易发生。当抗体浓度恒定时，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。随稀释度的增加，抗原抗体的比例发生变化，沉淀线由靠近抗血清孔向逐步移向两孔中间，并可出现不典型的沉淀线如弧形、八字须形、斜线形，这些也是阳性，应予注意。

（2）组电泳缓冲液其电泳结果以巴比妥钠—盐酸缓冲液灵敏度最高。巴比妥—巴比妥钠次之。Tris缓冲液更差。

（3）电压与电流时电泳时间需要长些：电压电流增大时，电泳时间可更短。但电压过高则孔径变形，电流过大抗原抗体蛋白易变性，干扰实验结果。一般选择每厘米5毫升，电泳时间改为1.5小时。