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直接凝集实验(Direct agglutination reaction)

标签: 直接凝集 玻片 试管 实验

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一、概述

颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应的抗体血清混合后,在电解质参与下,经过一定时间,抗原抗体凝聚成肉眼可见的凝集块,这种现象称为凝集反应。血清中的抗体称为凝集素(Agglutinin),抗原称为凝集原(Agglutinogen)。

细菌或其他凝集原都带有相同的电荷(阴电荷),在悬液中相互排斥而呈均匀的分散状态。抗原与抗体相遇后,由于抗原和抗体分子表面存在着相互对应的化学基团,因而发生特异性结合,成为抗原抗体复合物。由于抗原与抗体结合,降低了抗原分子间的静电排斥力,抗原表面的亲水基团减少,由亲水状态变为疏水状态,此时已有凝集的趋向,在电解质(如生理盐水)参与下,由于离子的作用,中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷,使之失去了彼此间的静电排斥力,分子间相互吸引,凝集成大的絮片或颗粒。出现了肉眼可见的凝集反应。

一般细菌凝集均为菌体凝集(O凝集),抗原凝集呈颗粒状。有鞭毛的细菌如果在制备抗原时鞭毛未被破坏(鞭毛抗原在56℃时即被破坏),则反应出现鞭毛凝集(H凝集),鞭毛凝集时呈絮状凝块。

二、玻片凝集反应

玻片凝集反应一般用于未知细菌的定性,所以又称为定性凝集反应。实践中常用于新分离的大肠杆菌和沙门氏菌的鉴定和分型。反过来,也可用已知的细菌抗原去鉴定未知抗体,如鸡白痢沙门氏菌病的清群就是采用已知鸡白痢菌抗原去检测鸡白痢抗体。

(一)材料与试剂

载玻片、已知抗血清、待测细菌等。

(二)操作方法

取洁净载玻片一张,用铂金耳钓取已知诊断血清1滴置于载玻片一端,另端置生理盐水1滴做对照。然后用铂金耳钓取被检细菌少许,置生理盐水滴中研磨混匀,再将铂金耳灭菌后冷却,钓取被检菌少许置于血清滴中研磨混匀。

(三)结果判定

在1min~3min内,血清滴出现明显可见的凝集块,液体变为透明,盐水对照滴仍均匀混浊,即为凝集反应阳性,说明被检菌与已知诊断血清是相对应的。注意如环境温度过低,则可将玻片背面与手背轻轻摩擦或在酒精灯火焰上空拖几次,以提高反应温度,促进结果出现。

三、试管凝集反应

(一)材料与试剂

以布氏杆菌病试管凝集反应为例。

1、试管(1cm×8cm)、试管架、恒温箱、吸管等。

2、布氏杆菌病标准阳性血清、标准阴性血清、布氏杆菌试管凝集用抗原。

3、布氏杆菌病待检血清。

4、0.5%石炭酸生理盐水。

(二)操作方法

1、试管4支,另取对照管3支,共7支试管,置于试管架上。如检多份血清,则对照只需做一份。

2、按表4-1加入0.5%石炭酸生理盐水,另用1ml的刻度吸管吸取0.2ml待检血清加入第一试管中。反复吹吸5次混匀。

3、以第1试管中吸取1.50ml弃之,再吸取0.50ml加入第2试管中,第1试管尚剩0.50ml。按第1管的办法吹吸混匀第2管,再从第2管吸取0.50ml放入第3管,以此类推,将第4管混匀后,弃去0.50ml。第5管只加0.5%石炭酸生理盐水0.50ml,第6管加1┱25稀释的布氏杆菌病标准阳性血清,第7管加1┱25稀释的布氏杆菌病标准阴性血清0.50ml。

4、将购买的布氏杆菌凝集抗原以0.5%石炭酸生理盐水做1┱20稀释,使每ml含菌为8亿,每管加0.50ml。

5、全部加毕后,一起振摇,混匀,放入37℃度温箱12h~14h,取出后至室温2h~4h,观察并记录结果。 

(三)结果判定

结果用“+”表示反应强度。

++++:液体完全透明,菌体完全被凝集呈伞状沉于管底。

+++:液体透明,菌体基本被凝集沉于管底。

++:液体不甚透明,管底有明显的凝集沉淀。

+:液体透明度不明显或不透明,有不明显的沉淀或有沉淀的痕迹。

—:液体不透明,呈均匀混浊,管底无凝集。有时有少量菌体集中于管底中心,呈脐状,但振摇时,立即散开呈均匀浑浊。以出现“++”的最高血清稀释倍数即为该份血清的效价,又叫凝集价。大动物(马,牛,骆驼等)以凝集价1┱100以上判为阳性,1┱50的凝集价判为可疑。中小动物(猪,羊,狗等)以凝集价1┱50以上判为阳性,1┱25的凝集价判为可疑。如对照管不符合要求时,试管须废弃重做。

(四)注意事项

1、结果为可疑时,隔2~3周后采血重做。阳性畜群,重检时仍为可疑,可判阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者,马、猪重检仍为可疑者,判阴性,牛、羊血清重检仍为可疑者,可判为阳性,或以补反等核对。

2、对阴性畜群,初检为可疑,复检仍为可疑(即效价不升高者),为慎重起见,可进行补反或细菌分离,如补反和细菌分离均为阴性者,可判为阴性。

3、化验结果通知畜主时,必须注明凝集价。

4、凝集反应用的血清必须新鲜,过度溶血的血清也不好。用0.5%石炭酸防腐的血清,也最好在15日内检测完。

5、在试管凝集反应中,抗原抗体的比例是非常重要的,必须进行摸索,特别是在新建立一项试管凝集反应时,如抗体比例过大,即稀释倍数较小,可出现假阴性现象,即在“++++”的前几管可出现“—”或低于“++++”的反应强度,这种现象就叫前带现象。如进行马流产伤寒沙门氏血清试管凝集反应时,就可能出现这种前带现象。

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