一、材料与试剂

1、副结核分枝杆菌亲和层析抗原

2、草分枝杆菌吸收抗原

3、兔抗牛IgG酶标抗体

4、牛副结核病参考阳性血清

5、牛副结核病参考阴性血清

1～5项均由指定单位供应。

6、器材 ELISA板， 酶联免疫吸附检测仪、加样器、洗瓶、恒温箱等。

7、试剂及溶液配制同第五节猪瘟ELISA.。

二、操作方法

1、抗原包被 以抗原稀释液将副结核亲和层析抗原稀释至50µg/ml,每孔包被0.1ml.部分对照孔以牛血清白蛋白(50µg/ml)包被。

2、血清处理 取待检血清、参考阳性血清、参考阴性血清各0.10ml，加生理盐水0.80ml，加草分枝杆菌吸收抗原0.10ml，混匀，37℃感作1h.取0.10ml，加血清稀释液0.90ml(注意血清稀释液中加牛血清白蛋白，不加犊牛血清)。混匀即可

3、正式试验 按表12－4进行。每个样品加2孔，以求OD平均值。

表12－4 ELISA试验程序表（单位ml）

三、结果判定

在对照组成立的前提下， 即参考阳性血清呈棕黄色，参考阴性血清及其它对照孔呈无色或浅黄色， 判定待测结果。

1、目测判定 与参考阳性血清孔颜色相当，即呈棕黄色，判为ELISA阳性(＋)。

2、酶标仪判定(490nm) 以底物溶液对照孔调零，校正参考阳性血清OD值为1.0(或相应规定值)，测定待检孔。当OD≥0.50，判ELISA阳性(＋)；0.40≤OD≤0.49判ELISA可凝(±)；OD<0.40，判ELISA阴性(－)。