【摘要】化学发光免疫测定方（Chemiluminescence immumo—assay，CLIA）重复性好、操作简便、快速、无放射性危害，临床很有价值。特异性阻断试验证明CLIA技术检测血清中抗原或抗体特异性强。敏感性试验结果表明CLIA方法检测血清中抗原或抗体的最低限度为0.05ng/ml，明显高于ELISA法和RIA法。

【关键词】化学发光标记免疫测定；酶联免疫吸附技术；放射免疫测定技术

[中图分类号]R446  [文献标识码]A   [文章编号]1606—8025（2004）05-377-03

目前，已经公认检测小分子激素和大分子蛋白等物质最灵敏和特异的方法是放射免疫测定方法（RIA）。然而，由于方法中使用放射性同位素，因而不可避免地存在同位素试剂有效期短、放射性污染和操作等弊端。迄今，已有不少其它标记物用来代替放射性同位素。其中以酶免疫测定法（ELISA）和免疫荧光法（IF）较为成功。ELISA和IF方法中实验条件已统一稳定并有成套试剂盒供临床应用。但是，这两种方法的灵敏度多半不如RIA。

1977年nalman将化学反应系统与免疫系统相结合，创建了化学发光免疫测定法（CLIA），以检测抗原或抗体。它既有免疫反应的特异性，更兼有发光反应的高敏感性。发光反应是一种物质在催化剂作用下，由基态跃迁到激发态，激发态不稳定，当回到基态时释放出的能量表现为光的发射。发光可分为三种类型：光照发光、生物发光和化学发光，在免疫学检验中应用最广的是化学发光。化学发光是指在常温下由化学反应产生的光的发射，化学发光是一个多步骤的过程，是某些化合物（发光剂或发光底物）利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态，当此产物分子或中间分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。化学发光免疫技术主要分为化学发光酶免疫测定、化学发光标记免疫测定及电化学发光免疫测定。用化学发光免疫标记物代替放射性同位素，避免了使用放射性同位素的危害，操作方法简便，检测迅速。

1、化学发光酶免疫测定（CIEIA）

CLEIA法是采用化学发光剂做为酶反应底物的酶标记免疫测定。常用的标记酶有两种即辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。HRP标记的CIEIA中常用的底物为鲁米诺或其衍生物，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol／L pH8.6 Tris缓冲液作底物液。AP标记的CIElA中常用的底物为ADP及其衍生物PPD。目前，这两种方法都已得到了广泛的应用。在心血管疾病方面，LDH-C（低密度脂蛋白一胆固醇）的增高是动脉粥样硬化发生发展的主要脂类危险因素，过去只测中总胆固醇估计低密度脂蛋白胆固醇的水平，但总胆固醇也受HDL—c（高密度脂蛋白--胆固醇）水平的影响，美国国家胆固醇教育计划成人治疗专业组规定以LDL-C水平做为高反映蛋白血症的治疗决策。Wu等人L6采用CILIA法测定LDL-C，结果显示动脉粥样硬化组和高血压组与正常对照组有显著性差异（P=0.001，P=0.001），因此准确灵敏地测定LDL-C的水平对粥样硬化的早期诊断及治疗有明显的意义。在肿瘤疾病方面，Einarsson等人用CLEIA法和RIA法同时测定血清中TPS，结果两种方法的相关数r=0.961，批内批间变异系数分别为3.8％，5.2％，均在允许范围内，所以可以用CILIA法代替RIA法测定血清中TPS，对肿瘤的预防及治疗有显著意义。在性激素方面，黄岚等人CLEIA法、ELISA法检测睾酮，血清中睾酮的含量很低，准确地检测出含量对临床有很重要意义，在男性用于研究性机能的减退，在女性血清睾酮的增高常提示肿瘤的可能性。黄岚等人[8]的测定结果显示ELISA法测定的灵敏度为0.196ng／ml，CLEIA法检测的灵敏度为0.063ng／mL，二法的相关系数r=0．971，所以得用CLEIA法代替RIA法及时准确的检测血清中睾酮的含量对临床有很重要意义。Del等人[9]测定绝经后期骨质疏松患者的尿中free-deoxypyfidino-line（DPD），分别采用ELISA法、CLEIA法、HPIE（高效液相色谱法）法三种方法测定，结果显示三种方法中ELISA法和CLEIA法是最好的辨别骨质疏松症的方法。在测定甲状腺功能方面，梁雁等人建立了增强CLEIA法的测定，目前国内尚无应用CLEIA法测定血清促甲状腺素（TSH）的先例，国外有用电化学发光测定TSH的病历报导，梁雁等人通过正交实验、并经方差分析，确立了HRP及其标记物化学发光分析的最佳实验条件，结合TSH-ELISA试剂盒建立了TSH—ECLIA法。血清中TSH是反映甲状腺功能的灵敏指标，原发性甲状腺功能减退时，TSH明显升高，应用RIA法即可明显诊断，但在甲状腺功能亢进时，TSH被抑制，灵敏度不够高的RIA法无法将其与正常水平区分。而ECLIA法的发光动力学曲线属稳定的持续发光，发光强度衰减缓慢，灵敏度比RIA、ElISA法高20倍，批内批间变异系数分别为3.95％，6.98％，与RIA、ELISA法有显著相关性（r=0.94，r=0.98），用此方法明显检测出甲亢患儿TSH值（0.06—0.219mTU／L）均低于正常水平（0.36--5.60mTU／L），可基本分清甲状腺功能亢进，低下，正常三种状态，适用于临床甲状腺功能的评估，该方法避免了RIA的放射性危害及半衰期短等缺陷，因此认为此新技术有望在TSH的测定中逐步取代RIA及ELISA法，但ECLIA法对实验条件的要求较高，其稳定性及敏感性尚待进一步提高。

2、化学发光标记免疫测定（CLIA）法

CLIA法是以化学发光底的直接标记抗原或抗体的免疫测定方法。常用的标记发光剂有鲁米诺、异鲁米诺及吖啶酯类。鲁米诺类的发光反应必须有催化剂如氯化高铁血红素等，致使本底较高，因而影响其灵敏度。80年代Patel等采用吖啶脂为发光剂，改进了标记方法此法氧化反应不需催化剂，只要在碱性环境中就可进行，从而提高了测定的灵敏度。目前，CLIA法已得到临床实验室的广泛应用。在细菌学方面，建立了用鲁米诺标记抗体检测伤寒杆菌抗原的方法，如Roekhill[17]的SPA协同凝聚法和Barrett[18]的ELISA法检测vi抗原，这些方法在灵敏度和特异性方面仍有够理想，CLIA法测定Vi抗原的灵敏度为0．024ng/L，较文献中报道的ELISA法高41倍[18]，检测范围为0.0061—400ng／ml，从特异性，灵敏度和检测范围看，Vi抗原的CLIA法检测很有希望成为早期快速诊断伤寒的一种新的免疫测定法。在炎症方面，蒋滋慧等人n5用鲁米诺标记抗体测C反应蛋白（CRP），CPR在正常人血清中含量甚低（1-3ug/mL）。以前传统的火箭电泳法和放射免疫法也能测到数值[20]，但是采用CLIA法不仅具有RIA的灵敏度高及特异性强的优点，而且还无同位素污染和需要防护的缺点，且CLIA法与火箭电泳法及RIA法有显著相关性（r=0.94，r=0.96），因此CLIA法完全可以替代RIA法。由于吖啶酯标记抗体的发光免疫法简便易行，标记条件温和，不易损伤被标物质微量物质，所以它的应用范围比鲁米诺类更为广泛开展。如刘农乐[21]等人采用吖啶脂类发光剂标记抗体测表皮生长因子，特异性及灵敏度均为RIA相似。施秉仪等[22]人用吖啶脂发光剂标记抗体测载脂蛋白AI、AⅡ和B中，重复性不够满意需进一步提高外，它的优点很多，如灵敏度高、测样时间短（1—10s）、特异性强、标准曲线范围较广、标记抗体稳定性好[22]、无毒性、固体载体珠和标记化合物廉易得等，因此可以期望这种新技术有可能在载脂蛋白测定中逐渐替代放免法。

3、电化学发光免疫测定（ECLI）法

ECLI法发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钉还原为激发态的二价钌，随即释放光子而恢复溪基态的发光底物，这一过程在电极表面周而复始地进行，不断发出光子而常保持底物浓度的恒定。目前，此种方法也得到了广泛的应用。在甲状腺功能方面，Forest等人例采用ECLI法作甲状腺功能指标的检测（TT3、TT4、TSH），结果显示ECLI法与RIA法有显著相关性（TT3：r=0．94，TT4：r=0.93，TSH：r=0.95），批内变异系数均小于5％，批间变异系数均小于6.5％，所以用ECLI法测定甲状腺功能完全可以取代RIA法。在肿瘤方面，Nonmm等人用ECLI法检测了AFP，Van—Ingen—HE等人检测了CA125，Forest等人检测PSA、CEA，并分别与ELISA法、RIA法做了比较，结果显示有显著的相关性（A：r=0.962，CA125：r=0.95，PsA：r=0.955，CEA：r=0.968），且操作简便、快速、有较高的准确性及灵敏度，为肿瘤的预防及治疗提供了可靠的诊断依据。在性激素方面，Ehrhardt等人采用ECLI法测定血清中B-HCG，发现用ECLI法测B-HCG的灵敏度及准确度均很高，并有较宽的线性范围，ECLI法测B—HCG样本携带污染率为0％，与其它成分（如LH、FSH等）无交叉反应，为早期在正常妊娠的妇女提供及时准确的诊断依据。在药物浓度监测方面，苏薇等人采用ECLI法对药物地高辛（DIG）进行浓度监测，把测定的灵敏度提高到了10E-15g/ml，使药物浓度的分析技术有了更新的进展。

4、全自动化学发光免疫测定

目前，国外自动化学发光免疫分析仪也已大量应用于临床。如Beckman公司生产的ACCESS是高灵敏度的全自动分析系统。应用的标记酶为碱性磷酸酶，发光底物为二氧乙烷（setane）磷酸酯，固相载体为磁性微粒，特殊的试剂组合及全封闭的自动化检测保证了测试的稳定性和重复性，类似的分析系统有Diagnostic production corporation公司生产的IMMUILE。Panteghini等人及Robert等用ACCESS测定磷酸肌酸激酶（CK—MB）、肌红蛋白、肌钙蛋白I亚单位，发现肌红蛋白在心肌梗塞（AMI）最早出现，46h后即消失，肌钙蛋白I亚单位在心肌损伤4—6h出现，12h达高峰，在血中停留6--8d。CK—MB不仅存在于心肌细胞中，还存在于骨骼肌细胞中，所以只有肌钙蛋白I亚单位是急性心肌梗塞的早期标志物。Ued等人[14]报导了用ACCESS测定性激素，结果显示该法测定FSH、LH、PRL等快速准确，为临床提供及时准确的诊断数据，并减少患者候诊时间。ACS180是由Chiron公司生产的吖啶酯为标记物，以磁性微球为载体的自动分析系统。Konig等人用此机器检测了flXSA，具有简便、快速、准确的优点，对前列腺癌的早期诊断具有重要意义。现有资料证明，化学发光标记物比酶标记物稳定性好，易长期稳定贮存。鲁米诺-IgG结合物-20℃至少稳定9个月，吖啶酯标记的抗体可稳定一年以上，近来，Boehringer Mannheim公司利用电化学发光原理开发的免疫测定系统称为ELECSYS，1997年才投人大量生产，在该系统中采用链霉素亲和素包被磁性微粒配以生物素结合的抗原或抗体，使反应几乎在液相中进行、具有敏感快速和稳定的特点，在固相标记免疫测定技术中居领先地位。

综上所述，不难看出，放射免疫分析技术因标记物的放射性在应用中存在不少问题，而化学发光免疫测定的敏感性高，甚至超过RIA，精密度和准确性均可与RIA相比，试剂稳定，无毒害，测定在耗时短，测定项目多，为临床提供可靠的诊断依据，并已发展成自动化测定系统，因此化学发光免疫测定在医学检验中不仅能取代RIA，而且可得到更为广泛的应用。

参考文献（略）