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对错误信号的处理和检测操作的优化的系统化处理方法的导言。 在近些年来，体外诊断产业（IVD）增加了巨大的投入来开发基于膜技术的快速检测试纸条。类似的的检测已经应用在临床和非临床领域。在早期的论文中 已有一篇是关于这些方法得到广泛应用的综述。 虽然基于膜技术的快速检测试纸条是相当简单的，但是此方法的实行的效果 依赖于大量的关键参数，在《体外诊断技术》的早期论文中已经探讨了金标液（gold conjugate）的质量和与膜结合的蛋白捕捉的方式的重要性。此篇论文探讨了导致产生假阳性和假阴性信号的错误的检测操作的可能原 因，并且提供了一套解决此类问题和优化检测效能的系统方法。虽然此文章是有 针对性地说明了胶体金检测技术中的相关问题，但是在胶乳检测技术中也能发现类似的问题。 为了避免重复，我们假定读者熟悉快速检测技术的机理和快速检测试剂的基本特性——尤其是抗体、金标粒子、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸收垫——并且熟悉检测中用于处理不同试纸条和硝酸纤维素膜的各种化学试剂。对于不 熟悉这些概念的读者，在其他文章里已经对此进行了详细的解释。 假阳性结果和假阴性结果的特征 假阳性结果是样品中没有待检测物时在检测带上出现了一条彩线（对于金标 而言是红线）。这条线可能在检测的初期或在一段明显的时间延迟之后出现。假 阴性结果是有可检的阳性样品时在抗体捕捉点上没有出现一条可见的线。 假信号可能在许多种样品中发生，也可能仅仅发生在一种特定类型或来源的 样品中。这个问题可能出现于一个单独检测批次的每个样品，也可能仅仅发生于一个样品检测中随机数量的检测带。后一种情况说明了对于整个操作而言在进行下一步前进行每个步骤时对大量检测带的处理的重要性。甚至在整个操作水平时从标准阴性样品中也可能发现假阳性结果，同样对于标准阳性样品亦是如此。由于批次检测失败后的巨大的成本损失，因此在进行达 到大量产生前对假阳性和假阴性结果准确判断和产生原因的了解是必要的。 假阳性和假阴性信号的产生有许多不同的原因。这些信号可能由样品或由检 测技术本身的设计缺陷和操作不当引起。我们可以通过在研制时的每个步骤进行 彻底的、反复的大量的检测装置的试验可以消除产生假信号的潜在因素。
图 1 在抗体和一个胶体金颗粒之间的结合力 当进行检测时，假阳性或假阴性结果产生的原因有时是由信号的观测产生， 也可能由于流动相的特征导致假信号的产生。然而，假信号出现的理由一般并不 经常是显而易见的。我们一般依赖于经验、系统和科学的方法、详细的故障排除 预案可以消除假信号的产生并且组织它们发生。在调整任何特异性参数之前，检 测技术的开发者应当十分熟悉使检测技术更为可靠的因素和可能引起错误的因 素。如果对快速检测技术有了充分的理解，那么没有必要采用经验的方法。 对于基于膜技术的快速检测技术工作机理的详细的描述和对于假阳性和假 阴性结果的详细的故障排除操作手册不在这个篇幅短小的论文讨论范围之内。相 反，此篇论文扼要讲述了对引起这些问题的原因的典型特征并且主要说明了处理 此类问题的方法。 假阳性产生的基本原因 大多数假阳性信号出现的原因是由于相似的问题，即在常规的结合 步骤进行时蛋白与胶体金颗粒特异性 结合。在此过程进行期间，蛋白质被三种主要的力 吸收在胶体金的表面上（图1）。 电荷引力 胶体金颗粒带有负电荷，这是由于在将氯金化钠转化为胶体金时，使用的还原剂（经常是柠檬酸盐） 带有的一层负电荷被吸附在胶体金颗粒的表面。负电荷将吸引带有正电荷的蛋白并且足以使其靠近结合区的表面，这样就有可能发生假阳性。低于等电点的蛋白带有正电荷，因此可能会与胶体金颗粒表面发生强烈的吸引作用。尤其是带有富 含赖氨酸和精氨酸的蛋白区域在低于赖氨酸的等电点（pH 10.4）和精氨酸的等 电点（pH 12.5）时会带有大量的正电荷。 疏水作用力 一旦蛋白质彼此十分接近（之间的距离大约小于 1nm），蛋 白质的任何疏水区很有可能与胶体金表面的疏水区接触并且与之结合。因此富含 非极性氨基酸（例如色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸）的蛋白质 会与胶体金表面发生强结合作用。 配位键结合力 配位键结合力是所有吸引力中最强的结合力。含有大量富含 硫的氨基酸（由于存在半胱氨酸和甲硫氨酸）的蛋白质强结合胶体金颗粒表面。 这是由于在金原子（具有传导带电子的能力）和硫原子（带有价电子）之间的吸 引力造成的。 当这三种结合力作用于金标颗粒上，它们会产生如下所述的假阳性信号并且 由此而对检测技术的效能产生不良的影响。 在采用系统的方法来诊断和消除假阳性信号之前，了解大多数（并不是所有 的）假阳性信号可能的原因是十分重要的。
图2 假阳性结果的主要来源 图2概要的描述了需要关注的主要 区域，而下面所描述的概括了大多数普通的 原因。然而，这些描述并不是一点也没有遗 漏。总体上来说，所有可能产生假信号的原 因与金标粒子、捕捉抗体、硝酸纤维素膜， 所加的化学试剂和样品联系在一起。通过对 这些潜在缘此的充分理解，在检测的操作过程中可以根据这些特征而做出迅速的判断。 由于金标粒子而产生的问题：由于某种原因金标粒子的表面由于没有被蛋 白质覆盖而会部分裸露。在干燥金标液或者在检测过程中，或者在第一步中金标 被涂得很少，这些都有可能导致抗体被去除。无论哪种原因，裸露的胶体金颗粒 将会被任何带有正电荷的蛋白质或硝化纤维素或尼龙膜所吸引。当胶体金颗粒通 过捕捉线，由于距离非常小而物理接触的可能性的非常大，这特别明显。因此有效地包被胶体金颗粒并且蛋白质在储存、处理或操作的过程中没有脱落，这两点是非常重要的。 除了胶体金颗粒对捕捉线的吸附外，标记抗体本身可能在特定的操作条件下被捕捉线吸附。这可能归结于电荷或疏水作用力，也可能是由于在此过程中的酸 性或离子环境。 过量的金标粒子会产生几个问题。首先，它能够提高在捕捉线上假阳性信号 的可能性，或则是由于大量的金标液通过这条线。其次，在检测期后，它也会提 高胶体金标粒子回流的可能性。一个好的品质的金标液不需要使用过量。 胶体金颗粒也可能聚集成簇，一般来说有很多原因，通常是由于操作失误所 致。胶体金簇如果多的话可能会堵塞膜孔。如果成簇的原因是由于胶体金的疏水 作用力形成的，那么在金标液流动的过程中胶体金颗粒也会粘附在捕捉抗体上。 无论待测物是否存在，金标的抗体都可能会与捕捉抗体发生非特异性免疫反 应。虽然在 ELISA 技术中在一对抗体之间发生类似的反应可能不是经常发生的， 但是这种方法会使硝酸纤维素膜上的标记抗体与捕捉抗体非常接近，从而提高了 发生非特异性免疫反应的可能性。另外，特别是在使用多克隆抗体时，有可能会 发生与样品中其它待测物的非特异性的反应，这种非特异性反应的发生与否主要取决于使用的抗体的纯度。 伴随捕捉抗体而产生的假阳性信号：有许多因素可能会影响捕捉抗体发生 非特异性结合反应。产生假阳性信号可以归结于疏水作用力、非特异性免疫反应 、 抗体中的添加物、带有大量的正电荷、在与胶体金颗粒吸附的捕捉抗体中富有高 浓度的含硫氨基酸。在标记过程中这些因素都会引起抗体与胶体金颗粒表面吸附 并与其结合。在实际的工作中，作用于捕捉抗体的这些因素会危及到快速检测技 术的效能。 与固相支持物相关的问题 硝酸纤维素膜非常脆并且在接触时很容易受到破 坏。因此在撕开膜的过程中避免与膜发生任何可能的机械接触是非常重要的。如 果应用捕捉抗体时膜被压制在捕捉抗体带上，那么在样品流动过程中，会提高金 标粒子发生非特异性反应的可能性。 两个方面能够使残余的金颗粒附着在捕捉抗体带上 ——金标粒子在膜中的 流速太慢或者是胶体金垫释放的速度富太慢。如果膜的孔径太小或者在检测带上没有足够的活性物质，再就是硝酸纤维素膜与金标液或与吸收垫的接触不良，那么这些情况就会发生。此外，由于硝酸纤维素膜是疏水的，因此会阻碍金标液顺 畅的流动。再加一句，有些样品可能非常具有粘性的（例如血清），这种因素也 会使流速减慢。当检测体系中没有足够的样品或活性物质来使金标沿着检测带移 动时，胶体金颗粒也会粘附在捕捉抗体带上。 如果花费很多时间来观测检测结果（通常是超过 15 分钟）时，膜就会变干， 多余的金标粒子很有可能开始从吸收垫向干燥后膜回流。由于干燥后的捕捉抗体 非常疏水，胶体金颗粒从吸收垫流向干燥后的捕捉抗体带的可能性非常高。 化学试剂问题：一些快速试纸条的厂家在有一个对硝酸纤维素膜进行封闭 的生产环节。当对特定的样品进行检测时，对硝酸纤维素膜的封闭将膜从层析分 离器（吸水的物质）转变成非层析分离带（非吸水的物质）。这种设计是为了提 高样品和金标粒子在膜带上的流速。 然而，采用在蛋白液或表面活性剂溶液中浸泡后对膜的封闭也有可能洗掉任 何化学试剂，这些掺入进去的化学试剂是厂家让膜不至于变得完全干燥和疏水 性。因此，在干燥的状态下这种封闭作用可能会让膜具有更强的疏水性，因此甚 至能在捕捉抗体带引起更为普遍的背景染色或假阳性信号。 采用过量的蛋白或活性剂进行封闭的方式都能够在样品流动过程中产生高 粘性，因此可能降低样品清除率。用不恰当的反应液进行封闭也会改变捕捉抗体 的特性，通过电荷作用力、疏水作用力或氢—硫作用力的提高会使其更具有粘附 性。封闭膜应当进京用于下面所述的理由，例如当需要提高样品或胶体金颗粒的 流动性，和仅仅需要最低的反应物浓度。 一些保护剂，不论在捕捉抗体中的、标记抗体中的或者是样品中的都能产生 假阳性结果。硫柳汞（含硫和汞的化合物）和赖氨酸（一般在 pH<10.4 下带有大 量的正电荷）在检测中是特别要注意的问题。 样品的问题：许多样品中含有可能与金标粒子或捕捉抗体发生非特异性结 合的物质，并且产生非特异性结果。举例来说，一些含有细菌的样品，而样品中 的细菌可能被部分破坏成细胞碎片，并且这些细菌是非常疏水的。这些疏水的细 菌碎片也可能与捕捉抗体和金标粒子发生交叉反应。 其它的一些样品可能含有高水平的硫或 SH 基团，或者具有高正电荷。此外，一些样品可能含有大量的分子或细胞分子，这有可能阻塞膜并且对检测带上的金 标液的流动产生干扰。
图 3 系统诊断假阳性信号的流程图 样品可能在酸性条件下变化非常大。例如，尿液样品最初的 pH 值是在 4~7 之间，然而随着细菌含量的增加，样品的 pH 值也随之降低。酸性样品在流动过 程中在捕捉抗体表面产生正电荷，反过来这将引起与带有负电荷的金标粒子发生 非特异性反应。 如果样品含有大量的酸性物质或者带有大量的正电荷蛋白质，它们在到达捕 捉抗体区之前可能与金标粒子非特异性结合。这不仅能掩盖待测物与金标的结合 信号（因此产生降低特异性信号效果），也能增加与在膜上和捕捉抗体带上成簇 物质的结合物。 |
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对假阳性结果诊断的补救措施 无论偶而还是重复出现假阳性结果，采用对于此类问题的诊断的一套系统的 方法也是为了实施最恰当的补救措施（见图 3）。最明显的原因首先是被注意到 的，主要有金标与捕捉抗体的反应；特异性电荷吸引力、疏水作用力和金-硫结 合力。 然后应当注意在抗体、特殊样品特性和跨膜流动特性的非特异性交叉反应。 使用对照能够迅速地找到问题的根源。 下面是系统的诊断方法的说明和前面所列的可能原因的参考。当采用任何系 统的诊断方法时，采用对照时，只能改变一个参数。采取这种方式，可以采取排 除法。下面的问题可能会有些帮助： 1、是电荷的原因吗？检测体系 pH 值的变化（pH5-11）表明了正电荷是否存 在和胶体金颗粒与捕捉抗体是否结合。 2、是疏水作用力的原因吗？这可能发生在固相中，捕捉抗体区或金标区。改 变体系中活性剂浓度对于疏水作用是否是主要因素可以提供头绪。 3、是金-SH 吸引的原因吗？最有可能发生在捕捉抗体带和样品浸入带中的 半胱氨酸和精氨酸的基团中。如下面部分的描述对这两个区域的仔细检查可以揭 示出问题的所在。 对于假阳性问题解决的系统方法 对于快速检测试纸条应用的大多数检测手段来说，一般只是采用一个测验条（或者是“半条”）。没有必要选择完全干燥的检测条。在检测的过程中，硝酸 纤维素膜直接被放置于含有金标液、样品和化学药品的微孔中，化学药品正常被放在干燥箱里。以这种方式，可以迅速简便地进行几种检测，并且不需要全装配装置和干燥箱。然而，如果由于干燥步骤而引起许多问题，那么在检测之前必须 进行完全装配。 这些关于系统方法的问题可以被划为下面与检测装置和元件相关的五个目录中。 产生的问题是与金标液相关吗？ 这个问题很好解决，换一种金标液就可以 了——举例来说，在相同浓度和相同的pH值下用 BSA-gold 替换最初的金标液。 如果问题还是没有消除，那么最为可能的原因是所带的电荷效应。如果换了金标 液后不再产生假信号，那么问题产生的原因最可能是最初的金标液的问题或者是 标记抗体的问题。在这里其他的对照是相似的金标液和含有单克隆抗体和多克隆 抗体的金标液。在市场上也有可用于此类检测的许多金标液。 下面是一个由于金标液而产生的假阳性信号的例子。应用的是针对于临床样 品（血清）检测传染性疾病的检测条。在所有的非阳性样品中都看到了假阳性结 果。当使用 BSA-gold 金标液后，假阳性信号消失了。而使用了另一种非特异性 金标液后，假阳性信号也消失了。然而，当更换了非临床对照样品，PBS 在 pH7.2 下，使用特异性金标液假阳性信号仍然存在，在使用其它的金标液则没有假阳性 信号。改变缓冲液的 pH 值为 10 后，减少了假阳性信号的发生，但是并没有消除 假阳性信号。因此我们可以得出结论，问题的产生与样品或捕捉抗体无关，而是 与对捕捉抗体席一行的高灵敏度的金标液。这些金标很可能含有裸金颗粒，这可 能与捕捉抗体发生结合。使用新的金标液并且小心制备金标可以消除假阳性信 号。 是捕捉抗体的原因吗？在这种情况下使用的对照是相似的捕捉抗体或其它 种类的抗体。然而在使用这些对照前，剥去 BSA 捕捉蛋白可以说明是不是其它地 方产生的问题。也有可能不是由于抗体本身而产生假阳性信号，而是由于在抗体 中的一些保护剂的原因。在这种情况下，在适宜的缓冲液（例如 10mmol PO4）中 进行透析可以改善情况。如果用了其它的抗体假阳性信号消失了，那么显而易见 是特异性捕捉抗体引起了假阳性信号，采取的措施是更换抗体或者清除它。举个 例子，在实际操作中，兔的单克隆抗体有时会产生这种情况，这主要是由于疏水 力的作用，需要采用特别的方法来处理。 检测尿中的ßhCG 的妊娠试验中对于所有样品都发现假阳性信号，无论这些样品本身是阳性还是非阳性。改变 pH 值没有消弱信号，更换金标液也没有作用。 甚至在使用 PBS 缓冲液对照样品也没有消除信号。 问题很可能是由于捕捉抗体引起的。剥去捕捉抗体带用 BSA 代替后所有的信号都消除了。在 10mmol 的 PO4 中透析最初的捕捉抗体后，最终的结果符合样品的实际情况。综合以上情况，我们可以得出结论：这些抗体曾经悬浮于含有 SH成分的缓冲液（譬如硫柳汞）中，我们要消除或者避免这些因素。 是膜的问题吗？任何检测带的开发中最重要的过程是选择合适的膜。有些膜与其它的膜相比而言可能只适于特定类型的检测或者只适合于特定的样品。开发 商应当有所有厂家的各种膜并且有各种孔径的膜，这样才能做出迅速的比较。举 例来说，在干燥的过程中膜的疏水性是显而易见的，因此我们可以清楚的知道这 批次的膜会产生随机的假阳性信号。 在选择快速检测技术所用的膜时不仅应当考虑到所要求的流速和蛋白结合特性，而且要考虑到在制备过程中膜的均质性。在这里需要用的对照是不同孔径和不同来源的膜，还有就是同一批次的膜的不同区域。 对于设计 H.pylori 的检测抗体的血清学试验，最初的试验的开发的目的是 在实验室设计阶段时不会产生假阳性或假阴性结果。只有进行全部测试合格后决 定检测技术可以转移到生产设计阶段。 当成比例扩大至几千个装置来进行检测条的组装过程时，无论如何，我们都应当在每一批次的生产过程都要记录很多随机产生的假阳性结果。调整pH值、使用另一种金标液和对捕捉抗体进行两次检查都不能立即揭示假阳性产生的原 因。重新在小规模的实验室设计阶段进行测试，由于假阳性结果的产生是在无 c 带时发生的，因此可以说明假阳性结果产生的原因是由于硝酸纤维素膜。 对于实验室设计研究，只是用了小批次的膜。这么小的量的结果并不能说明 是否符合大规模的生产。已经发现了大批次的膜有明显的疏水区（例如，没有正 常湿润的区域），这些疏水区会引起胶体金颗粒与捕捉抗体发生非特异性结合。 是化学药品的原因吗？在快速检测带的组装过程中，金标液和固相支持物（膜、结合垫或样品垫）可能用化学试剂预先处理过。所加的化学试剂可以包括 盐、活性剂、蛋白质、糖和聚合物。一些化学物质能够提高假阳性的几率。 在针对血清中动物蛋白的研究用的检测带的开发中，会发生一些假阳性结果。在实验室设计阶段，在应用检测带之前，通过向血清样品和金标液中加入制 备缓冲液后，然后再将检测带浸渍在微孔里来开始进行检测。更换金标液没有效 果。改变缓冲液的酸度并没有影响到结果。再换捕捉抗体也没有消除随机发生假 阳性结果。 此时用非阳性血清样品，在浸渍与血清样品之前，只有当缓冲液已经加入到 血清样品几分钟后，才会观察到假阳性结果的出现。缓冲液中含有 5%的强活性 剂。降低活性剂的浓度至 1%后，然后让血清和胶体金颗粒与缓冲液混合几个小 时，此时没有观察到任何假阳性结果。这说明了过量的活性剂会强作用胶体金颗 粒，会去除颗粒表面的抗体并且产生裸金颗粒，从而使其与捕捉抗体互相作用。 是样品的原因吗？由于酸度、样品污染、或孕尿翳含量等诸如此类的因素的 变化，正如前所述，样品能够引起不可预知的假阳性信号。为了确定是否是样品 的原因，需要检测很多不同的样品，其中包括类似的样品，也包括不同来源的样 品。除了样品的生物物质量或有机物量外，问题也可能存在于所使用的缓冲液。 如果是这个原因，需要用另一种缓冲液作对照。最简单调整的方式是改变样品的 酸度，这种方法可以很快确定是否是样品中电荷吸引力的作用而产生的问题。也 可能需要对样品进行过滤，过滤得步骤可以独立于检测程序，也可以作为检测步骤的一部分而使用。 在生产开发中采用针对于尿液中激素的快速检测技术对大量不同的尿液样品进行检测，其特异性可以达到 97%，而其灵敏度可以达到 98%。然而，在以后 的测试阶段发现从储藏的样品中发现几例假阳性结果。 在对这些样品的酸度的测量后发现酸度有所提高，但是经过等酸度水平的对 照缓冲液样品检测后可以排除酸度的影响。当对尿液样品进行过滤后没有产生假 阳性结果。然后进行显微镜观察后发现样品的细菌污染是产生假阳性的主要原因。 这样，我们可以得出结论细菌含量的增加会提高样品的疏水性，这会引起胶 体金颗粒和捕捉抗体的非特异性作用。新鲜的样品不会产生类似的问题。 假阴性产生的原因 与假阳性信号诊断流程图的制作相比，制作引起假阴性信号的诊断流程图需要考虑更多的因素，这超出了本文的范围。这主要是因为研究者常常在起始时没 有可见的信号的一无所知的情况下工作的。解决此类问题的方法也依赖于对照线 的出现或不出现，然后样品和金标液沿着膜带流动。表 I 概括了假阴性信号产生 的大多数可能的原因。 如同假阳性的诊断过程，也有特定的症状帮助我们诊断假阴性结果。逐步找 出最可能的原因能够对问题进行分析并且作出改善。有人已经对类似的系统诊断 方法进行的整理。本篇文章主要是对绝大多数阳性样品中偶然产生的假阴性结果 进行详细的分析。如果在阳性临床样品中所有的检测带都产生假阴性结果，那么可能是检测带的设计的问题。
图 4 产生假阴性结果的主要来源 表1 一些产生假阴性的典型原因
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